IMPROVED TISSUE HOMOGENIZATION AND SPE-BASED SAMPLE PREPARATIONS FOR THE QUANTITATIVE LC-MS ANALYSIS OF OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS

Význam tématu

V oblasti farmakokinetiky a metabolismu léčiv je spolehlivá kvantifikace terapeutických oligonukleotidů v tkáních zásadní. Tyto molekuly často obsahují chemické modifikace a konjugáty, které mohou negativně ovlivnit výtěžnost extrakce a reprodukovatelnost analýzy. Optimalizované postupy homogenizace a přípravy vzorku jsou klíčové pro přesné vyhodnocení koncentrace oligonukleotidů v různých biologických matricích.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotila čtyři modelové antisense oligonukleotidy (GEM132, GEM91 a lipid-konjugovaná varianta) přidané do vzorků hovězí jater a vepřového mozku. Cílem bylo najít optimální podmínky tkáňové homogenizace, předúpravy s proteinázou K a extrakce pomocí WAX SPE mikrodesek tak, aby byla dosažena vysoká výtěžnost, minimální matriceové interferenc e a možnost přímé injekce do LC-MS.

Použitá metodika a instrumentace

Proces sestával z následujících kroků:

• Tkáňová homogenizace: kuličkový mlýn (15 s při 5800 rpm, 30 s pauza, znovu 15 s).
  
• Předúprava: inkubace s proteinázou K a organickým rozpouštědlem pro uvolnění oligonukleotidů; u lipid-konjugované formy přidání alternativního detergentu NP-40.
  
• SPE extrakce: WAX mikrodeskové sorbenty pro selektivní adsorpci, praní a eluci oligonukleotidů.
  
• Chromatografie: UHPLC s BEH C18 kolonkou (2,1×50 mm, 1,7 µm).
  
• Detekce: podporované jak benchtop TOF MS, tak Triple Quad MRM režimem.
  

Hlavní výsledky a diskuse

Protokoly vykázaly:

• Vysoké a reprodukovatelné výtěžnosti (>90 %) pro všechny testované oligonukleotidy.
  
• Minimální interferenci matrice v hmotnostních spektrech.
  
• Lipid-konjugovaná oligonukleotidová varianta profitovala z přidání NP-40 alternativy.
  
• Výtěžnost byla nezávislá na množství použité tkáně, což umožňuje využití i omezeného materiálu.
  
• Přímá injekce eluátu eliminovala další sušení a rekonstituci, čímž se šetřil čas a minimalizovaly ztráty.
  
• Data byla reprodukovatelná i bez vnitřního standardu.
  

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný postup umožňuje selektivní extrakci oligonukleotidů z různých typů tkání s vysokou citlivostí a přesností. Microplate formát zkracuje dobu přípravy a snižuje množství vzorku. Metoda je kompatibilní jak s full scan TOF MS, tak s MRM na Triple Quad MS.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizovaných kitových workflow, rozšíření spektra analyzovaných modifikovaných oligonukleotidů a integrace s vysokorychlostními platformami pro screening. Dále lze uvažovat o aplikacích v klinických studiích a kvalitativním monitorování biologických vzorků.

Závěr

Navržené postupy homogenizace a SPE extrakce poskytují robustní, reprodukovatelné a časově efektivní řešení pro kvantitativní LC-MS analýzu terapeutických oligonukleotidů v tkáních.

Použitá instrumentace

• Bead mill pro homogenizaci tkáně.
  
• Proteináza K pro enzymatickou degradaci proteinové matrice.
  
• WAX mikrodesková SPE zařízení (OligoWorks).
  
• UHPLC systém s BEH C18 kolonkou (2,1×50 mm, 1,7 µm).
  
• TOF hmotnostní spektranalyt a Triple Quad MS (MRM režim).
  

Reference

1. Araya M et al (2023) Elements of Robust SPE-Based Oligonucleotide Extraction, 720008141.
   
2. Lee M, Tanna N, Trudeau M (2023) Development of a Standardized, Kit-Based Approach for Selective and Reproducible Sample Preparation and Extraction for Therapeutic Oligonucleotides from Biological Matrices, 720008086.
   
3. Tanna N, Trudeau M, Lee M (2023) An Automated, Standardized, Kit-Based Sample Preparation Workflow for Bioanalytical Quantification of Therapeutic Oligonucleotides, 720008068.
   
4. Tanna N, Trudeau M (2024) Quantification of a Lipid Conjugated Antisense Oligonucleotide (ASO) Extracted From Rat Plasma Using the OligoWorks SPE Microplate Kit on a HRMS System, 720008256.
   
5. Tran KV, Trudeau M, Lauber M (2018) High Oligonucleotide Recovery From Liver Tissue, 720008270.
   
6. Waters Corporation (2024) OligoWorks Kits, online zdroj.