Application Note 205 Determination of Cefepime and Cefepime- Related Substances Using HPLC with UV Detection

Význam tématu

Cefepim je širokospektrální čtvrtá generace cefalosporinů, často používaná v nemocnicích. Jeho β-laktamový kruh je však náchylný k hydrolýze a fotolýze, což zvyšuje riziko vzniku nežádoucích nečistot. Spolehlivá analýza čistoty a koncentrace je proto klíčová pro zajištění bezpečnosti léčiv.

Cíle a přehled studie

Studie představuje úpravy oficiálních metod USP a EP pro stanovení nečistot a assay cefepimu pomocí HPLC-UV. Cílem je zkrátit dobu analýzy, zlepšit rozlišení blízkých struktur a validovat parametry jako linearitu, preciznost, LOD/LOQ a stabilitu vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

• HPLC systém Dionex UltiMate 3000: pumpa DGP-3600M, autosampler WPS-3000T, kolona compartment FLM-3100/TCC-3200, detektor VWD-3400 UV-Vis.
• Kolony: Acclaim 120 C18 3 μm (2.1 × 150 mm) a Acclaim PolarAdvantage 3 μm (2.1 × 150 mm).
• Mobilní fáze: 5 mM KH₂PO₄/ACN (6/94, 10/90, 50/50) pH 5.0, filtrace 0.2 μm, průtok 0.2 mL/min, teplota 30 °C, objem injekce 1 μL.
• Příprava vzorků: cefepim HCl 1.4 mg/mL v deionizované vodě, skladování při 4 °C a -19 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

• Standardní USP metoda na Acclaim 120 C18 překročila požadavky na rozlišení (RSA >23, RSB >120), asymetrie 1.4, teoretické destičky >9600.
• Snížení podílu acetonitrilu v mobilní fázi A na 6 % umožnilo oddělení impurity F na základní linii.
• Acclaim PA kolona dále zlepšila tvar špičky (asymetrie 1.1) a rozlišení impurity F (4.9) bez změny mobilní fáze.
• Zrychlený gradient (8 min izokrat, 10 min gradient, 5 min ekvilibrace) zkrátil dobu analýzy o 20 min při zachování kritérií preciznosti (RSD <0.3 %).
• Isokratické assay pro cefepim vykázalo linearitu 1–1400 μg/mL (r² >0.9999), LOD 0.03–0.06 μg/mL, LOQ 0.12–0.20 μg/mL, preciznost <0.1 %.
• Stabilita: po 96 h při -19 °C a 4 °C bez významné změny; při pokojové teplotě pokles koncentrace o 12 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Snižuje spotřebu organiky, odpad a dobu analýzy, čímž šetří náklady i čas.
• Zvyšuje produktivitu laboratoře díky rychlejším cyklům.
• Metody jsou plně kompatibilní s požadavky USP/EP pro kontrolu kvality léčiv.
• Kombinace assay a nečistot ve společné mobilní fázi zjednodušuje přípravu vysoce výkonné chromatografie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace stacionární fáze a mobilních fází pro zlepšení robustness 100% vodných metod.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci a kvantifikaci neznámých nečistot.
• Automatizace přípravy mobilních fází a rozšíření validací v různých farmaceutických matricích.
• Rozšíření na další β-laktamová antibiotika s podobnou chemickou strukturou.

Závěr

Navržené úpravy metod USP/EP s využitím kolony Acclaim 120 C18 a PA významně zkracují dobu analýzy a zlepšují rozlišení, při zachování nebo překročení požadavků na přesnost, citlivost a linearitu. Metody nabízejí úsporu času i zdrojů a jsou vhodné pro rutinní farmaceutickou kontrolu kvality.

Reference

1. Mutnick AH, Rhomberg PR, Sader HS, Jones RN. Antimicrobial Usage and Resistance Trend Relationships from the MYSTIC Programme in North America (1999–2001). J Antimicrob Chemother. 2004;53:290–96.
2. Rabouan-Guyon SM, Guet AF, Courtois PY, Barthes DMC. Stability Study of Cefepime in Different Infusion Solutions. Int J Pharm. 1997;154:185–190.
3. El-Shaboury SR, Saleh GA, Mohamed FA, Rageh AH. Analysis of Cephalosporin Antibiotics. J Pharm Biomed Anal. 2007;45:1–19.
4. Yahav D, Paul M, Fraser A, Sarid N, Leibovici L. Efficacy and Safety of Cefepime: A Systematic Review and Meta-Analysis. Lancet Infect Dis. 2007;7:338–348.
5. Sprauten PF, Beringer PM, Louie SG, Synold TW, Gill MA. Stability and Antibacterial Activity of Cefepime during Continuous Infusion. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47:1991–1994.
6. Dionex Corporation. Determination of N-Methylpyrrolidine in Cefepime Using a Reagent-Free Ion Chromatography System. Application Note 199. Sunnyvale, CA; 2008.
7. USP 30–NF 25 Supplement 1. United States Pharmacopeial Convention; 2007.
8. European Pharmacopeia, 4th ed. Council of Europe; 2002.
9. Evagelou V, Tsantili-Kakoulidou A, Koupparis M. Determination of the Dissociation Constants of the Cephalosporins Cefepime and Cefpirome using UV Spectrometry and pH Potentiometry. J Pharm Biomed Anal. 2003;31:1119–1128.
10. Pistos C, Tsantili-Kakoulidou A, Koupparis M. Investigation of the Retention/pH Profile of Zwitterionic Fluoroquinolones in Reversed-Phase and Ion-Interaction High Performance Liquid Chromatography. J Pharm Biomed Anal. 2005;39:438–443.