Integrated mass spectrometry-based analysis of plasma glycoproteins and their glycan modifications

Význam tématu

Glykozylace je nejrozšířenější a nejsložitější posttranslační modifikace proteinů, zasahující do jejich skládání, stability, aktivity, transportu a imunologických interakcí. V nádorových onemocněních vede kabnormální oligosacharidové struktury k rozvoji invazivity a metastáz, a zároveň slouží jako potenciální biomarkery pro diagnostiku a cílenou terapii.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout integrovanou platformu pro analýzu glykoproteomiky lidské plazmy založenou na hmotnostní spektrometrii. Metoda kombinuje určení sekvence proteinů, lokalizaci glykozylovaných míst a identifikaci složení oligosacharidů v rámci jednoho workflow.

Použitá metodika

• Imunodeplece plazmatických vzorků k odstranění vysoce abundatních proteinů
• Redukce (DTT) a alkylace (acrylamid) intactních proteinů
• Online 2D-HPLC frakcionace: 1. dimenze aniontová výměnná chromatografie, 2. dimenze reverzní fáze
• In-solution digesce frakcí trypsinem
• Enrichování glykopeptidů pomocí hydrofobně-interakční (HILIC) chromatografie
• Analýza ne-glykopeptidů LC-ESI LTQ-FT MS/MS pro identifikaci proteinů
• Offline LC-MALDI-DIT MS/MS pro charakterizaci glykopeptidů

Použitá instrumentace

• Shimadzu AccuSpot nano spotter pro online LC-MALDI
• Vlastní MALDI-DIT hmotnostní spektrometr (in-house)
• LTQ-FT hmotnostní spektrometr s ESI zdrojem
• 2D-HPLC systém s aniontovou výměnnou a reverzní fází
• HILIC kolona na bázi Sepharose

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikováno bylo 64 proteinů plazmy, z nichž 30 bylo potvrzeno jako glykoproteiny dle UniProt anotací. Pomocí LC-MALDI-DIT MS/MS bylo charakterizováno 34 glykoproteinů, přičemž 24 z nich odpovídalo známým glykoproteinům. Vzorky vykazovaly výraznou mikroheterogenitu glykovazeb na jednotlivých místech (např. komplementární faktory I a C4BPB či α-1-kyselý glykoprotein ORM2 nesly až šest různých oligosacharidů). Metoda prokázala schopnost současně určit sekvenci, lokalizaci glykozylace a glykanové složení.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní profilování glykoproteomiky s vysokou citlivostí a přesností
• Možnost objevování biomarkerů spojených s abnormální glykozylací v onkologii a dalších onemocněních
• Využití v QA/QC klinických a farmaceutických laboratořích pro kontrolu glykosylace terapeutických proteinů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj kvantitativních přístupů pro přesné měření změn glykozylace
• Integrace s pokročilou bioinformatikou a databázemi glykanových struktur
• Rozšíření metodiky na další biologické matice (např. buněčné lyzáty, tkáňové extrakty)
• Aplikace v personalizované medicíně pro monitorování pacientských biomarkerů

Závěr

Předložená integrovaná platforma pro analýzu plazmatických glykoproteinů kombinující LC-ESI LTQ-FT a LC-MALDI-DIT MS/MS představuje robustní a komplexní nástroj pro studium posttranslačních modifikací oligosacharidů. Metoda napomáhá pochopení biologického významu glykozylace a je perspektivní pro objev a validaci klinických biomarkerů.

Reference

1. Wang H et al. Intact-protein-based high-resolution three-dimensional quantitative analysis system for proteome profiling of biological fluids. Mol Cell Proteomics 4 618–625 2005
2. Fukuyama Y et al. Ionic liquid matrixes optimized for MALDI-MS of sulfated/sialylated/neutral oligosaccharides and glycopeptides. Anal Chem 80 2171–2179 2008
3. Wang H et al. Integrated mass spectrometry–based analysis of plasma glycoproteins and their glycan modifications. Nat Protoc 6 253–269 2011
4. Wada Y et al. Hydrophilic affinity isolation and MALDI multiple-stage tandem mass spectrometry of glycopeptides for glycoproteomics. Anal Chem 76 6560–6565 2004