WADC: High Resolution Mass Spectrometry of Antibody Drug Conjugates Using the Orbitrap Mass Analyzer

Význam tématu

Antibody drug conjugates (ADC) představují komplexní biologické molekuly kombinující monoklonální protilátky a cytotoxické látky. Jejich kvalitativní a kvantitativní charakterizace, včetně určení distribuce poměru léčiva k protilátce (DAR), je klíčová pro bezpečnost a účinnost těchto terapeutik. High resolution Orbitrap mass spectrometry umožňuje přesnou detekci a dekonvoluci různých forem ADC v denaturačních i nativních podmínkách.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrativně ukázat schopnosti Orbitrap Q Exactive Plus a HF s BioPharma Option pro analýzu intactních protilátek a ADC za tří provozních režimů (Normal, Protein, High Mass Range). Studie zahrnovala chromatografická rozdělení (reverzní fáze, SEC) a datovou dekonvoluci s nástroji BioPharma Finder pro stanovení DAR a glykozilačních forem.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Vanquish UHPLC, reverzní fáze MAbPac RP (ACN gradient 10–90 % s kyselinou mravenčí) pro denaturační analýzu, velikostní exkluze s 50 mM NH4OAc pro nativní analýzu.
• Mass spectrometry: Q Exactive Plus a Q Exactive HF s BioPharma Option v režimech:
  • Normal Mode (m/z ≤6000, standardní trapping gas)
  • Protein Mode (optimalizované tlumení, ΔHV nižší 5×)
  • High Mass Range Mode (m/z ≤8000, zvýšené S-lens RF nastaveno na 200)
• Data analysis: BioPharma Finder 2.0 s algoritmem ReSpect a funkcí Sliding Window, použití FASTA sekvencí ADC, tolerance 50 ppm pro identifikaci modifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza Brentuximab vedotin pod denaturačními podmínkami odhalila přibližně devět denaturovaných proteinových forem glykoform G0F a dalších variant. Dekonvoluce a Sliding Window integrace ukázaly průměrnou hodnotu DAR 4.07. Nativní SEC-MS analýza zachovala nekovalentní interakce a poskytla detailní profil DAR 0–8.
Trastuzumab emtansine vykázal podobné chování s průměrným DAR 3.71. Nativní podmínky vedly ke snížení počtu nabitých stavů a lepšímu rozlišení hmotnostních spekter u heterogenních ADC směsí.

Přínosy a praktické využití metody

Orbitrap s BioPharma Option rozšiřuje možnosti masové detekce větších proteinů až do m/z 8000 v jedné platformě. Kombinace nativní a denaturační analýzy umožňuje komplexní hodnocení struktury a heterogenity ADC v průmyslových laboratořích i klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj automatizované dekonvoluce ve větších datových sadách, rozšíření nativních technik pro studium proteinových komplexů a integrace ion mobility spektrometrie pro lepší separaci izoform a konformačních stavů ADC.

Závěr

Studie potvrdila, že kombinace různých provozních režimů na Orbitrapu s BioPharma Option, spolu s pokročilou chromatografií a analytickým softwarem, poskytuje robustní a přesné metody pro charakterizaci intactních ADC a stanovení klíčových parametrů jako DAR a glykoformy.

Reference

1. Rosati S. et al. In-depth qualitative and quantitative analysis of composite glycosylation profiles and other micro-heterogeneity on intact monoclonal antibodies by high-resolution native mass spectrometry using a modified Orbitrap. mAbs. 2013;5(6):917-924. doi:10.4161/mabs.26282.
2. Fenn J.B. et al. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 1989;246(4926):64-71.
3. Fenn J.B. Electrospray wings for molecular elephants. Angew. Chem. Int. Ed. 2003;42:3871–3894.
4. Dabaene F. et al. Innovative native MS methodologies for antibody drug conjugate characterization: High resolution native MS and IM-MS for average DAR and DAR distribution assessment. Anal Chem. 2014;86(21):10674-10683.
5. Lazar A.C. et al. Analysis of the composition of immunoconjugates using size-exclusion chromatography coupled to mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005;19:1806-1814.