Take a snapshot of your protein quality with Uncle

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé ověření kvality proteinových vzorků je nezbytné pro další bioanalytické aplikace. Fyzikální či chemické stresy během purifikace, skladování nebo manipulace mohou vést k unfoldování a agregaci proteinů, což negativně ovlivňuje funkčnost a spolehlivost následujících experimentů. Platforma Uncle umožňuje komplexní kontrolu integrity biologik pomocí kombinace fluorescence, statické (SLS) a dynamické (DLS) světelné rozptylové detekce.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat schopnosti Uncle k rychlé „snapshot“ analýze stability a integrity monoklonálních protilátek. Byly zkoumány tři modelové vzorky: mAb1, mAb2 a referenční NISTmAb. Vzorky byly podrobeny třem stresovým podmínkám (termální degradace, cykly zmrazování/rozmrazování, odlišné teploty skladování) a vyhodnoceny změny konformační stability, agregace a velikosti.

Použitá instrumentace

• Platforma Uncle (Unchained Labs) s aplikacemi Isothermal (fluorescence + SLS) a Sizing & Polydispersity (DLS).
• Spektrum fluorescence 250–720 nm, SLS při 266 a 473 nm.
• Lunatic (Unchained Labs) pro měření koncentrace UV/Vis A280 (2 µL vzorku).
• Mikrocentrifuga pro předčištění vzorků (10 000×g, 3 min).

Použitá metodika

Vzorky mAb1 a mAb2 byly připraveny v příslušných pufrech na koncentraci 0,5 mg/mL, NISTmAb na koncentraci 0,5 mg/mL po ředění. Termální stres probíhal při 75 °C po dobu 1 h. Cyklus zmrazování/rozmrazování byl uskutečněn šestkrát při −80 °C. Skladování mAb2 bylo monitorováno 7 dní při 4 °C a 25 °C. Pro Uncle bylo použito pouhých 9 µL vzorku v duplikátu; fluorescence a SLS se měřily při 25 °C s dvěma opakováními, DLS ve čtyřech akvizicích po 5 s.

Hlavní výsledky a diskuse

Termální degradace mAb1 vedla k výraznému nárůstu barycentrického maxima fluorescence (BCM), zvýšení SLS signálu při 266 nm a vzniku středně velkých agregátů (~70 nm) s vyšší PDI. U NISTmAb se změny fluorescence i SLS pohybovaly na šumu, DLS odhalila zanedbatelnou populaci větších částic (<0,1 % hm.).

Po šestinásobném cyklu zmrazování/rozmrazování mAb1 došlo ke zvětšení Z-Average hydrodynamického průměru až o ~20 nm, bez změny BCM, což naznačuje tvorbu nativních agregátů.

Sledování mAb2 po 7 dnech skladování ukázalo, že při 25 °C dochází k mírnému nárůstu BCM fluorescence, zatímco při 4 °C je vzorek stabilní. Hydrodynamický průměr zůstal u obou podmínek kolem 10 nm.

Měření A280 prokázala snížení koncentrace po termálním stresu o ~36 % u mAb1 a pouze ~9 % u NISTmAb, což potvrzuje rozdílnou odolnost.

Přínosy a praktické využití metody

Uncle nabízí komplexní QC kontrolu proteinů během několika minut s minimálním množstvím vzorku (9 µL) a možností paralelního zpracování až 48 vzorků. Kombinovaná data o conformaci, agregaci a velikosti usnadňují rozhodování o vhodnosti vzorků pro další analýzy a formulaci biologik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Platforma může být integrována do vysokoprůtokových screeningů stability, optimalizace formulací a vývoje prediktivních modelů shelf-life. Další kombinace s technikami jako DSC nebo hmotnostní spektrometrie umožní ještě komplexnější profilování proteinových bioterapeutik.

Závěr

Uncle se ukázal jako efektivní nástroj pro rychlý „snapshot“ kvality proteinových vzorků. Díky simultánnímu hlídaní fluorescence, SLS a DLS poskytuje spolehlivá data o unfoldování, agregaci a velikosti proteinů s minimální spotřebou vzorku, což zkracuje čas přípravy a snižuje riziko selhání následných analýz.

Reference

1. State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 2. Biopharmaceutical Characterization: The NISTmAb Case Study. John E. Schiel et al., ACS, 2015.