Optimizing IP-RP CRISPR sgRNA Purification Passes With High Efficiency Oligonucleotide Certified BEH 300 Å C18 5 μm Preparative Sorbent

Význam tématu

Purifikace sgRNA je klíčová pro minimalizaci off-target modifikací a zajištění vysoké přesnosti CRISPR genetické editace. Ion-pairing reverzní fázová chromatografie nabízí účinnou separaci plné délky RNA od syntetických vedlejších produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo porovnat purifikační účinnost 100mer sgRNA na různých přípravkových kolonách řízených IPRP-LC, se zaměřením na nově komercializovanou 5 µm BEH 300 Å C18 sorbent, a vyhodnotit čistotu, retenci nečistot a kapacitu naložení.

Použitá instrumentace

• Waters LC Prep 150 System s modularem 2545 Quaternary Solvent Manager, 2489 UV/Visible Detector a WFC III
• Waters ACQUITY UPLC H-Class Plus s BioQuaternary Solvent Manager, Bio Sample Manager FTN-H a ACQUITY Premier Tunable UV Detector
• Kolony:
  • XBridge Peptide BEH C18 OBD Prep 10 µm 300 Å 19×250 mm
  • XBridge Oligonucleotide BEH C18 OBD Prep 5 µm 300 Å 19×150 mm
  • PS-DVB 8 µm 300 Å 25×150 mm
  • ACQUITY Premier Oligo BEH C18 1.7 µm 300 Å 2.1×100 mm

Hlavní výsledky a diskuse

Použití 5 µm BEH 300 Å C18 kolony vedlo ke zvýšení čistoty frakcí z ~35 % na 41–45 % a ke snížení předběžných nečistot z ~16 % na ~11 %. Menší částice poskytly vyšší povrchovou plochu, lepší vazbu a separaci složek. PS-DVB kolona (8 µm) vykázala pouze 34–37 % čistoty a nestabilní tlak, zatímco 10 µm BEH kolona nedokázala dostatečně oddělit blízko elující nečistoty.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená čistota sgRNA pro přesnou genovou editaci
• Snížení rizika off-target delecí či mutací
• Vyšší kapacita naložení materiálu pro průmyslovou škálu
• Opakovatelnost a mechanická stabilita kolon

Budoucí trendy a možnosti využití

Optimalizace deprotekčních kroků v syntéze sgRNA pro odstranění pozdně elujících nečistot, použití konkávních nebo konvexních gradientů, kombinace slabého a silného iontového párování či sekvenční aniontová výměna a IPRP-LC umožní další zlepšení purity a výtěžnosti.

Závěr

Studie potvrdila, že XBridge Oligonucleotide BEH C18 5 µm 300 Å kolona je ideální pro vysokoresolucní purifikaci sgRNA, díky lepší separaci nečistot a vyšší kapacitě naložení. Budoucí práce se zaměří na optimalizaci syntézy a gradientních profilů pro kompletní odstranění vedlejších produktů.

Reference

1. Villiger L, Joung J, Koblan L et al. CRISPR technologies for genome, epigenome and transcriptome editing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25:464–487.
2. Nakamura M, Gao Y, Dominguez AA et al. CRISPR technologies for precise epigenome editing. Nat Cell Biol. 2021;23:11–22.
3. Minkner R, Boonyakida J, Park EY, Wätzig H. Oligonucleotide separation techniques for purification and analysis: What can we learn for today's tasks? Electrophoresis. 2022;43:2402–2427.