Column Selection for RPLC-UV Impurity Analysis of Fatty Acid Modified GLP-1 Receptor Agonists

Význam tématu

Rychle rostoucí poptávka po GLP-1 receptorových agonistech modifikovaných mastnými kyselinami vytváří potřebu spolehlivých chromatografických metod pro detekci nečistot ovlivňujících jejich kvalitu. Robustní RPLC UV metody umožňují zachytit i nízkoabundantní varianty léčiv s cílem zajistit jejich bezpečnost a účinnost.

Cíle a přehled studie

Práce se zaměřuje na porovnání čtyř různých chemických fází RPLC kolon pro analýzu nečistot dvou mastnými kyselinami modifikovaných GLP-1 agonistů, liraglutidu a semaglutidu. Cílem bylo identifikovat optimální kombinaci kolony a chromatografických podmínek pro selektivní rozlišení nečistot a následné potvrzení jejich identity pomocí MS.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatograf: ACQUITY UPLC I Class PLUS
• Kationické fáze: CORTECS Premier C18+ 1,6 µm a 2,7 µm, ACQUITY Premier Peptide CSH C18, ACQUITY Premier CSH Phenyl Hexyl, ACQUITY Premier BEH C8
• Teplota kolony 60 °C, teplota vzorku 6 °C, objem injekce 6 µl
• Mobile fáze: 0,1 % TFA ve vodě (A) a 0,1 % TFA v acetonitrilu (B)
• Gradientní eluce: plošná změna 1,1 % CV pro plně pórovité kolony, 1,7 % CV pro pevné jádro
• Detekce UV: trihluoroctová kyselina pro nízký šum a vysokou kapacitu píků
• MS podmínky: ESI pozitivní mód, m/z 50–2000, kapilární napětí 1,2 kV, kuželové napětí 20 V, desolvatace 350 °C

Hlavní výsledky a diskuse

• Různé kolony vykazují odlišnou selektivitu: C18+ a Peptide CSH lépe separují varianty liraglutidu, zatímco C18+ a CSH Phenyl Hexyl u semaglutidu.
• Strukturální rozdíly v délce mastné kyseliny a chemii spojovacího můstku zásadně ovlivňují retenci a rozlišení.
• Přechod z 1,6 µm na 2,7 µm částice vede k mírné ztrátě rozlišení, ale metoda zůstává škálovatelná na konvenční HPLC.
• Optimalizace gradientu pro fenyl hexyl fázi odstraňuje rušení fenolem a odhaluje další slabé nečistoty.
• Použití TFA umožňuje kvalitní UV separaci, přesto lze i za iontového potlačení detekovat nečistoty až 0,1 % pomocí MS.
• Formiová kyselina jako alternativní přísada zvyšuje MS signál, avšak s nižší UV kapacitou a odlišnou selektivitou.

Přínosy a praktické využití metody

• Nabízí systematický přístup ke screeningovému výběru kolony při vývoji metod pro lipopeptidové léky.
• Poskytuje výchozí podmínky pro analýzu nečistot nejen u GLP-1 agonistů, ale i u dalších mastnými kyselinami modifikovaných peptidů.
• Umožňuje identifikaci nízkoabundantních oxidovaných či izomerických variant.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další testování různých aditiv mobilní fáze pro optimalizaci MS kompatibility.
• Škálování metod pro standardní HPLC a vysokoteplotní aplikace.
• Přizpůsobení kolonových chemii pro širší spektrum lipopeptidů a biotechnologických produktů.
• Integrace s vysokorozlišovacími MS pro hloubkovou charakterizaci nečistot.

Závěr

Práce potvrzuje, že při RPLC UV analýze nečistot mastnými kyselinami modifikovaných GLP-1 agonistů je klíčové individualizovat výběr kolony a chromatografických podmínek podle chemické struktury analyzovaného peptidu. Prezentované kolonové fáze a optimalizované gradienty tvoří silný základ pro vývoj robustních QC metod v biofarmaceutickém průmyslu.

Reference

• Watanabe JH, Kwon J, Nan B, Reikes A. Trends in Glucagon like Peptide 1 Receptor Agonist use, 2014 to 2022. Journal of the American Pharmacists Association. 2024;64:133–138.
• Clements BR, Rainville P. Development of Separation Methods for GLP 1 Synthetic Peptides Utilizing a Systematic Protocol and MaxPeak High Performance Surface Technology. Application note. Waters Corporation; 2024.
• Knudsen LB, Lau K. The Discovery and Development of Liraglutide and Semaglutide. Frontiers in Endocrinology. 2019;10:155.
• Koza SM, Chambers EE. Selecting a Reversed Phase Column for the Peptide Mapping Analysis of a Biotherapeutic Protein. Application note. Waters Corporation; 2017.