Accurate and consistent analysis of poly(A) tails of mRNA therapeutics on a UHPLC-HRAM-MS platform

Význam tématu

V posledních letech se mRNA terapie staly klíčovou technologií pro vývoj vakcín a léčby infekčních onemocnění i nádorů. Kvalita a účinnost mRNA molekul závisí mimo jiné na délce a homogenitě poly(A) ocasu, který ovlivňuje stabilitu a translaci. Rychlé, přesné a reprodukovatelné metody pro kvantifikaci délky poly(A) ocasu jsou nezbytné jak ve výzkumu, tak v kvalifikačních a výrobních procesech mRNA terapeutik.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout automatizované, komplianci schválené řešení pro přesné a konzistentní stanovení délky poly(A) ocasů in vitro transkribovaných (IVT) Cas9 mRNA. Studie demonstrovala přenos metodiky IPRP-UHPLC-HRAM-MS mezi třemi LC–MS systémy pomocí Chromeleon CDS eWorkflow postupu a ověřila reprodukovatelnost dat na více přístrojích.

Použitá metodika a instrumentace

Princip metody:

• In vitro transkripce Cas9 mRNA a enzymatická digesce RNase T1.
• Selektivní extrakce poly(A) ocasů pomocí magnetických kuliček Dynabeads Oligo(dT)25.
• IPRP-UHPLC separace na Vanquish Horizon UHPLC se DNAPac RP kolonkou.
• HRAM-MS analýza v negativním iontovém módu na Orbitrap Exploris 240 a Orbitrap Exploris MX (BioPharma Option).
• Automatizace a zpracování dat v Chromeleon CDS verze 7.3.2 s Xtract dekonvolučním algoritmem a eWorkflow procedurou.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza tří odděleně připravených vzorků poly(A) ocasů vykázala rozsah délek od 117 do 132 nukleotidů s mediánem kolem 124–125 adenosinů. Měřené monizotopové hmotnosti odpovídaly teoretickým hodnotám s přesností pod 5 ppm. Výsledky byly vysoce konzistentní jak mezi replikáty na jednom LC–MS systému, tak mezi třemi různými přístroji. Nová funkce automatického zpracování dekonvoluce v Chromeleon CDS umožnila okamžité vygenerování zpráv o délce poly(A) ocasů bez nutnosti manuální intervence.

Přínosy a praktické využití metody

• Přesná a reprodukovatelná kvantifikace délky poly(A) ocasů na jednotkové nukleotidové úrovni.
• Kompletní kompliance-ready eWorkflow od vzorku až po report vhodné pro QC prostředí.
• Rychlý přenos metody mezi laboratořemi a přístroji se zkrácenou dobou implementace.
• Možnost kontinuálního monitoringu kvality mRNA terapeutik během vývoje i výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření podobných HRAM-MS postupů pro komplexní charakterizaci dalších modifikací mRNA (pseudouridinizace, kapování na 5´ konci) a jejich integrace s automatizovanými platformami pro vysokoprothroughputové screeningové aplikace. Dále je možné zkombinovat LC-MS s bioinformatickými nástroji pro hloubkovou analýzu sekvenčních variant a agregátů.

Závěr

Vyvinutá IPRP-UHPLC-HRAM-MS metoda ve spojení s Chromeleon CDS eWorkflow poskytuje robustní, přesné a automatizované řešení pro analýzu délky poly(A) ocasů IVT mRNA. Přesnost pod 5 ppm a konzistence napříč třemi LC–MS systémy potvrzují vhodnost metody pro rutinní QC a vývoj mRNA terapeutik.

Reference

• Clifford TH, et al. mRNA-LNP expressing PfCSP and Pfs25 vaccine candidates targeting Plasmodium falciparum. NPJ Vaccines. 2022;7(1).
• Neuzil KM. An mRNA Influenza Vaccine—Could It Deliver? N Engl J Med. 2023.
• Qin S, et al. mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7.
• Beverley M, et al. Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2018;410:1667–1677.
• Thermo Fisher Scientific. Characterization of IVT mRNA poly(A) tail by LC-HRAM-MS and BioPharma Finder 5.0. Application Note 001183.