A simple and robust LC-MS method for determination of poly(A) tail length using the Orbitrap Exploris MS systems

Význam tématu

Analýza délky poly(A) ocasu mRNA je klíčová pro hodnocení stability a účinnosti syntetických mRNA terapeutik, včetně vakcín. Přesné stanovení délky tohoto repetitivního úseku umožňuje optimalizovat translaci, zlepšit expresi cílových proteinů a zajistit konzistenci výrobního procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem publikované práce bylo vyvinout přímou a robustní LC-MS metodu pro přesné měření délky poly(A) ocasu in vitro transkribované mRNA. Studie popisuje aplikaci vysokorozlišovacího a vysoce přesného hmotnostního spektrometru Orbitrap Exploris a integraci Chromeleon eWorkflow pro automatizované zpracování dat.

Použitá metodika a instrumentace

Všechny kroky byly provedeny v následující instrumentaci:

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Horizon
• Kolona DNAPac RP pro ion-pairing reverzní fázi
• Orbitrap Exploris 240 a Orbitrap Exploris MX hmotnostní spektrometry
• Chromeleon CDS verze 7.3.2 se zabudovanou funkcí Xtract pro dekonvoluci izotopicky rozlišených dat

Pro purifikaci byla použita oligo(dT)25 magnetická kuličková separace, enzymatické štěpení RNAse T1 zajistilo selektivní uvolnění poly(A) ocasu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje rozlišení 180 000 při 200 m/z, což umožňuje přímé měření monoisotopických hmot s přesností lepší než 5 ppm. Poly(A) ocasy z Cas9 mRNA měřené na třech přístrojích vykazovaly délku od 117 do 132 nukleotidů, s mediánovou hodnotou 124–125. Chromeleon eWorkflow zaručilo reprodukovatelnost výsledků mezi všemi systémy a usnadnilo rychlé reportování.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé stanovení délky poly(A) ocasu v rozsahu jednotek nukleotidů bez potřeby cDNA konverze
• Vysoká přesnost a rozlišení usnadňují kontrolu kvality výrobních šarží mRNA terapeutik
• Automatizace zpracování dat zkracuje dobu analýzy a snižuje riziko lidské chyby

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat adaptaci na vyšší průtok vzorků a rozšíření metodiky na analýzu modifikovaných mRNA či dalších typů RNA. Integrace strojového učení do datového workflow by mohla zlepšit detekci vzácných variant poly(A) ocasu a jejich vliv na biologickou aktivitu.

Závěr

Popsaná LC-MS metoda poskytuje spolehlivé a přesné měření délky poly(A) ocasu syntetických mRNA s jednoduchou přípravou vzorku a automatizovaným vyhodnocením. Umožňuje robustní kontrolu kvality a přispívá ke zrychlení vývoje mRNA léčiv a vakcín.

Reference

• Clifford T. H. et al. mRNA-LNP expressing PfCSP and Pfs25 vaccine candidates targeting infection and transmission of Plasmodium falciparum. NPJ Vaccines, 2022; 7(1): DOI: 10.1038/s41541-022-00577-8
• Neuzil K. M. An mRNA Influenza Vaccine—Could It Deliver? New England Journal of Medicine, 2023; DOI: 10.1056/NEJMcibr2215281
• Qin S. et al. mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2022; 7:166
• Mulligan M. J. et al. Phase I/II Study of COVID-19 RNA Vaccine BNT162b1 in Adults. Nature, 2020; 586:589–593
• Beverley M. et al. Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2018; 410:1667–1677
• Thermo Fisher Scientific. Application Note 001183: Characterization of in vitro-transcribed (IVT) mRNA poly(A) tail by LC-HRAM-MS and BioPharma Finder 5.0 software. 2023