Subunit Level Top-down ECD Characterization of Biotherapeutic Proteins: Improving Mass Spectral Clarity with Fragment Ion Level Ion Mobility

Význam tématu

Charakterizace bioterapeutických proteinů na úrovni subjednotek je klíčová pro přesné určení struktury a post-translačních modifikací.
Elektronová zachycovací disociace (ECD) umožňuje získat komplementární data k běžným kolizně indukovaným metodám a zachovat labilní vedlejší řetězce.
Zařazení iontové mobility (IMS) na úrovni fragmentů výrazně zvyšuje jasnost hmotových spekter a rozšiřuje sekvenční krytí.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo otestovat a optimalizovat top-down ECD analýzu na cyklické IMS hmotnostní spektrometrii.
Modelovými vzorky byly bovinní karboanhydráza II a tři redukované/digestioné podjednotky NIST monoklonální protilátky (scFc, LC, Fd).
Studie porovnala tradiční CID, samotné ECD a kombinaci ECD s IMS ve stejném experimentálním uspořádání.

Použitá metodika a instrumentace

Pro kvalifikaci a optimalizaci ECD buňky byla infuze BCA (10 µM v 50:50 methanol:ddH₂O) při 10 µL/min.
Likvidní chromatografie (LC/MS) probíhala na ACQUITY UPLC Premier H-Class s BioResolve RP mAb Polyphenyl kolonu.
ECD buňka e-MSion byla instalována před sekcí iontové mobility na SELECT SERIES Cyclic IMS.
Datové zpracování využilo MassLynx 4.2, waters_connect (BayesSpray dekonvoluce) a ProSite Lite2 pro anotaci fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

U BCA (prekurzorový iont 25+, m/z=1162) samotné ECD generovalo velmi komplexní spektrum; zařazení IMS umožnilo výrazně lepší rozlišení fragmentů.
Srovnání sekvenčního krytí BCA: 11 % (CID), 76 % (ECD), 81 % (ECD-IMS), tj. o 154 více identifikovaných fragmentů.
Analýza podjednotek mAb po IdeS štěpení a redukci proběhla během 10 minut: scFc (3,98 min), LC (5,31 min), Fd (7,41 min).
Při cílených ECD experimentech dosáhla scFc subjednotka 52% sekvenčního krytí na analytické LC/MS úrovni.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá top-down charakterizace proteinových subjednotek a jejich PTM.
• Zachování labilních modifikací díky jemné fragmentaci N–Cα vazeb.
• Implementace na rutinní LC/MS platformy pro QA/QC v biotechnologickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší aplikace ECD-IMS pro komplexní biologické matrice a nové bioterapeutické molekuly.
• Další vylepšení softwarových nástrojů pro automatizovanou dekonvoluci a anotaci velkých datasetů.
• Integrace s dalším rozšířením IMS kapacit pro vyšší rozlišení a rychlejší analýzu.

Závěr

Top-down ECD ve spojení s cyklickou iontovou mobilitou poskytuje výjimečné spektrální rozlišení a vysoké sekvenční krytí.
Metoda je efektivní jak při nanoflow infuzi, tak na analytické LC/MS míře, vhodná pro detaily strukturální charakterizace bioterapeutik.
Výsledky potvrzují potenciál adaptace této techniky do rutinních analytických workflow v biofarmaceutickém sektoru.

Reference

• Shion H., Williams B.J., Cooper-Shepherd D., Yu Y.Q. Subunit Level Top-down ECD Characterization of Biotherapeutic Proteins: Improving Mass Spectral Clarity with Fragment Ion Level Ion Mobility. Waters Corporation, 2021.