Simplified Analysis Workflow – Determination of Vitamins B1, B2, B3, B5, and B6 in Infant Formula

Význam tématu

Vitamin B1, B2, B3, B5 a B6 jsou klíčové složky pro růst a vývoj kojenců. Jejich přesné stanovení v kojeneckých mlécích je nezbytné pro zajištění správného složení výživy a dodržení regulačních norem. Moderní chromatografické metody s UV detekcí umožňují rychlé a spolehlivé kvantifikace těchto vitamínů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat jednoduchý analytický postup pro simultánní stanovení B1, B2, B3 a B6 a samostatné stanovení B5 v kojeneckém mléce. Vzorky jsou připraveny s využitím trichloroctové kyseliny pro srážení bílkovin a analyty jsou separovány na HPLC s diode array detektorem (DAD).

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Prime LC systém
• Moduly: flexibilní pumpa, multisampler, multicolumn termostat
• 1290 Infinity II DAD s 60 mm InfinityLab Max-Light cartridgí
• Softwarové vybavení: Agilent OpenLab CDS 2.7

Použitá metodika

Vzorek (2 g) se extrahuje vodou a 0,6 M TCA, následuje centrifugace a filtrace na 0,2 µm RC membráně. Pro B1, B2, B3 a B6 se využívá C18 kolona 3,0 × 100 mm (2,7 µm), mobilní fáze A: SDS ve vodě s kyselinou mravenčí (pH 2,8), B: acetonitril, gradient 5–80 % B za 10 min, detekce při 268 a 296 nm. Pro B5 se použije stejná kolona s mobilní fází A: KH2PO4 (pH 2,8) a B: methanol, gradient 4–70 % B za 10 min, detekce při 205 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearity kalibračních křivek (0,05–20 µg/mL; B5 0,5–50 µg/mL) vykázala R2 = 1,000.
• LOQ se pohybovalo mezi 0,006 až 0,093 µg/mL pro B1, B2, B3, B6; pro B5 bylo 1,040 µg/mL kvůli nižší absorpci.
• Repeatabilita: RSD retence < 0,3 %, plocha < 1 % (B5 plocha RSD 3,94 %).
• Recovery v NIST 1869 SRM mezi 91,7–118 % (B3 kyselina nicotinová nebyla detekována).
• Analýza komerčního vzorku ukázala koncentrace B1 5,82 µg/g, B2 10,73 µg/g, B3 38,51 µg/g, B5 38,84 µg/g, B6 3,96 µg/g.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup kombinuje jednoduchou extrakci s vysokou průchodností vzorků a spolehlivou detekcí. Využití InfinityLab Max-Light cartridgí zvyšuje poměr signál/šum pro vitamín B5 a umožňuje přesné stanovení slabě absorbujících analit.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na kompletní spektrum B vitaminů včetně folátů (B9) a B12.
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s online hydrolýzou.
• Využití fluorescence či MS detekce pro zvýšenou citlivost a selektivitu.
• Miniaturizace kolonek a ultrarychlé chromatografie pro vyšší vzorkovací kapacitu.

Závěr

Vyvinutý workflow pro stanovení vitaminů B1, B2, B3, B5 a B6 v kojeneckém mléce prokázal vysokou přesnost, opakovatelnost a robustnost. Metoda splňuje požadavky pro nutriční označování a regulaci kvality potravin.

Reference

• Hanna M et al. B Vitamins: Functions and Uses in Medicine. The Permanente Journal. 2022;26(2):89–97.
• Ting L, Lin Y. The Analysis of Vitamin B12 in Infant Formula. Agilent Technologies application note. 2023.
• Ting L, Lin Y. Simultaneous Analysis of Vitamin B7, B9, and B12 in Infant Formula. Agilent Technologies application note. 2024.
• Fanali S, Haddad PR, Poole CF, Schoenmakers PJ, Lloyd D. Liquid Chromatography: Applications; Elsevier Science. 2013.
• Woollard DC, Indyk HE. Rapid Determination of Thiamine, Riboflavin, Pyridoxine, and Niacinamide in Infant Formulas by Liquid Chromatography. Journal of AOAC International. 2002;85(4):945–951.
• Romera JM, Ramirez M, Gil A. Determination of Pantothenic Acid in Infant Milk Formulas by High Performance Liquid Chromatography. Journal of Dairy Science. 1996;79(4):523–526.