Emerging Alternative Analytical Techniques for Oligonucleotide Separation and Purification: HILIC & SEC

Význam tématu

Díky rostoucímu významu terapeutických oligonukleotidů je potřeba efektivních analytických metod pro jejich separaci a čistění. Tradiční techniky jako iontové párování v reverzní fázi a iontově výměnná chromatografie mají omezení v kompatibilitě s hmotnostní spektrometrií a požadavcích na dedikovanou instrumentaci. Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) nabízí alternativu s kompatibilními mobilními fázemi pro MS a flexibilním využitím instrumentace. Velké oligonukleotidy vykazují vyšší řádové struktury a tendenci ke agregaci, kterou lze monitorovat standardní technikou Size Exclusion Chromatography (SEC).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyhodnotit vhodnost HILIC a SEC pro analytickou separaci oligonukleotidů a porovnat různé HILIC stacionární fáze pomocí Tanaka testu. Studie dále zkoumá vliv pH mobilní fáze na rozlišení DNA a RNA standardů a demonstruje využití SEC sloupce s velkými póry pro hodnocení vyšších struktur a agregací mRNA oligonukleotidů.

Použitá instrumentace

• Agilent Technologies HPLC systém vybaven modulárními pumpami a injektorem kompatibilními s HILIC a SEC analýzami
• HILIC kolony: InfinityLab Poroshell 120 HILIC (2.1×150 mm), HILIC-OH5, HILIC-Z; AdvanceBio Glycan Mapping; AdvanceBio Amide HILIC
• SEC kolona: AdvanceBio SEC 1000 Å, 2.7 µm, 7.8×300 mm
• Detektor hmotnostní spektrometrie kompatibilní s organickými mobilními fázemi HILIC

Použitá metodika a instrumentace

Pro HILIC byly připraveny mobilní fáze na bázi 10 mM roztoků ammonium acetátu upraveného na pH 4.4, 6.8 nebo 9.0 v kombinaci s acetonitrilem. Pět různých stacionárních fází bylo testováno pomocí Tanaka testu ke stanovení charakteru interakcí (hydrofobita, hydrofilita, vodíkové vazby, iontová výměna, tvarová selektivita). Pro SEC analýzu mRNA a DNA standardů byla použita Tris acetátová s EDTA nebo fosfátová pufr při průtoku 0.6 mL/min a teplotě 40 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC screening odhalil rozdíly v retenci oligonukleotidů v závislosti na chemické povaze stacionární fáze a pH mobilní fáze. Sloupec HILIC-Z prokázal stabilitu při pH 9 a umožnil lepší rozlišení DNA i RNA standardů. SEC analýza ukázala, že díky větším pórům 1000 Å se oligonukleotidy chovají odlišně oproti globulárním proteinům, což umožňuje spolehlivé sledování agregace a vyšších struktur mRNA. Zvýšení pH zároveň vedlo k ostřejším píkům a posunům retenčního času v HILIC-LC/MS měřeních.

Přínosy a praktické využití metody

HILIC přináší univerzální přístup ke charakterizaci oligonukleotidů s plnou kompatibilitou pro LC/MS a eliminuje nutnost dedikovaných zařízení pro iontové párování. SEC se svou optimalizovanou pórovitostí umožňuje robustní sledování konformací a agregací terapeutických mRNA, klíčové pro kontrolu kvality a stability bioléčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj stacionárních fází s vyšší pH stabilitou a cílenými funkčními skupinami pro jemnější rozlišení sekvenčních a sterických vlastností. V oblasti SEC budou testovány nové rozsahy pore size a kombinovaná multidimenzionální řešení pro detailní pohled na vyšší řádové struktury. Integrace těchto metod do automatizovaných QC platforem zvýší propustnost a reprodukovatelnost analýz.

Závěr

Studie potvrzuje, že HILIC a SEC představují efektivní alternativy k tradičním chromatografickým technikám při analýze a čistění oligonukleotidů. Implementace těchto přístupů umožní flexibilnější workflowy, lepší kompatibilitu s MS a spolehlivé sledování agregace i konformací, což je zásadní pro rozvoj a kontrolu kvality oligonukleotidových léčiv.

Reference