Improved Oligonucleotide LC–MS Performance through Inert Column Hardware and Alternative Separation Strategies

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů pomocí LC–MS je klíčová pro charakterizaci terapeutických nukleových kyselin, kontrolu kvality a výzkum. Tradiční ion-pair reverzní fáze (IP-RP) poskytuje dobrou separaci, ale vyžaduje perfluoroalkylové přísady (např. HFIP) a aminy, které zhoršují ekologický profil, kontaminují instrumentaci a podporují aduktaci v MS. Minimalizace kontaktu analytů s kovovými povrchy a alternativní chromatografické režimy (ion-pair-free RP, HILIC) mohou zlepšit zotavení, tvar píků a kvalitu spekter, zatímco snižují závislost na problematických reagentech.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo porovnat tradiční IP-RP separaci s ion-pair-free RP a HILIC pro analýzu různých oligonukleotidů a zhodnotit přínos inertního sloupkového hardware a inertního LC průtoku (včetně polypropylenových lahví na rozpouštědla) ke snížení interakcí s kovovými povrchy a ke zlepšení MS dat. Testovány byly standardy RNA a DNA a několik modelových vzorků (25-mer, 50-mer, plně thiolované ON, 2-MeO RNA).

Použitá metodika a instrumentace

Souhrn přístrojového vybavení a postupů:

• HPLC: Agilent 1290 Infinity II Bio HPLC.
• MS: Agilent 6545XT AdvanceBio QTOF.
• Sloupce: komerčně dostupné AdvanceBio Oligonucleotide a Altura Oligo HPH-C18 porovnány se stejnými stacionárními fázemi v provedení Ultra Inert/Prototype Ultra Inert a se standardním nerezovým (SS) tělesem.
• Solventní systém: pro IP-RP se používaly aminy s HFIP (ion-pair reagent), pro IP-free RP výhradně amonné pufry (ammonium bicarbonate) a pro HILIC amonné acetáty v silně organickém prostředí (ACN). Teploty sloupců, průtoky a injekční objemy byly optimalizovány podle režimu separace.
• Další opatření: porovnání použití skleněných vs. polypropylénových lahví na rozpouštědla a inertního vs. SS průtoku.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění studie zahrnují:

• Inertní sloupkové těleso výrazně zkracuje dobu stabilizace nových sloupců a snižuje počet potřebných kondičních injekcí. Navíc vyšší doba zotavení vzorku byla dosažena u Ultra Inert oproti SS (recovery nižší u SS o ~13–17 %).
• Při použití Ultra Inert hardware bylo možné snížit koncentraci ion-pair reagenčních látek (hexylamin/HFIP) bez ztráty selektivity — podmíněno delším gradientem — zatímco SS sloupce ztrácely schopnost rozlišit blízké sekvence při snížené koncentraci IP reagentu.
• Snížení obsahu kovových kontaminantů v průtoku a nahrazení skleněných lahví polypropylénovými výrazně omezilo tvorbu sodíkových aduktů, což zjednodušilo dekonvoluci a interpretaci MS dat.
• IP-free RP v pozitivním ionizačním režimu produkovalo celkově silnější signál a méně aduktů než IP-RP v negativním režimu pro kratší oligonukleotidy; celkově však IP-RP poskytovalo nejlepší chromatografickou separaci, zejména u delších sekvencí.
• HILIC ukázal svou sílu v odhalování komplexních profilů nežádoucích produktů/impurit (např. u 2-MeO RNA) a s podporou MS umožňuje jejich identifikaci a charakterizaci.
• Hodnoty přesnosti hmotnosti pro testované oligonukleotidy byly dobré (většina měřených chybiček v řádu jednotek ppm); u plně thiolovaného ON byla na jednom nastavení pozorována větší odchylka, která se snížila při nižším průtoku.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické implikace výsledků:

• Nasazení inertního hardware (Ultra Inert sloupce, inertní průtok) a polypropylénových lahví výrazně zlepšuje robustnost LC–MS analýz oligonukleotidů — rychlejší uvedení sloupců do rovnovážného stavu, vyšší zotavení analytů a méně aduktů v MS.
• Ion-pair-free RP a HILIC představují životaschopné alternativy ke klasickému IP-RP v aplikacích, kde je prioritou minimalizovat používání PFAS/aminů kvůli kontaminaci nebo environmentálním obavám. Pro kratší nukleotidy jsou tyto režimy obzvlášť atraktivní.
• Zmenšení koncentrace IP reagentů u inertního hardware snižuje provozní náklady a nároky na čištění instrumentů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Další optimalizace HILIC a ion-pair-free RP metod pro delší oligonukleotidy a modifikované nukleotidy s cílem zlepšit rozlišení bez návratu k PFAS-based systémům.
• Rozšíření inertních materiálů v LC průtokech (frits, spojky, ventily) a standardizace používání plastových lahví k redukci kovových a kovopodobných kontaminantů ve QC laboratořích.
• Integrace měření aduktace a automatizovaná dekonvoluce pro rychlejší interpretaci komplexních HILIC profilů a lepší monitorování nečistot u terapeutických oligonukleotidů.
• Vyvíjení ekologičtějších mobilních fází bez PFAS, podpořené instrumentálními úpravami, které kompenzují ztrátu ionizační účinnosti.

Závěr

Studie ukazuje, že kombinace inertního sloupkového hardware a alternativních separačních režimů (ion-pair-free RP, HILIC) umožňuje robustnější a „MS-přátelštější" analýzu oligonukleotidů. IP-RP zůstává špičkou v chromatografickém rozlišení, avšak pro kratší sekvence a pro aplikace citlivé na PFAS/aminy jsou ion-pair-free RP a HILIC vhodnými alternativami, zvláště pokud je použit vhodný inertní hardware a opatření k omezení kovových aduktů.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio HPLC.
• Agilent 6545XT AdvanceBio QTOF.
• Sloupce: Agilent AdvanceBio Oligonucleotide, Altura Oligo HPH-C18 a AdvanceBio Glycan Mapping (včetně prototypek v Ultra Inert provedení).
• Polypropylenové lahve na rozpouštědla a inertní LC komponenty pro snížení kovových interakcí.

Reference

1. Coffey A., et al. Eliminate Metal Ions from Your Oligonucleotide LC/MS analysis. Agilent application note 5994-9018EN. 2026.
2. Ryu C. Oligonucleotide Analysis Using the Agilent InfinityLab Pro iQ and Altura Oligo HPH-C18 Column. Agilent application note 5994-9057EN. 2026.
3. Bertram L., et al. Analysis of Oligonucleotides Using an Ion-Pairing-Free Reversed-Phase Method with TOF LC/MS. Agilent application note 5994-8013EN. 2024.
4. Hsiao J., et al. Evaluating HILIC Stationary Phases for Oligonucleotide Separation by LC/MS. Agilent application note 5994-8180EN. 2025.