PEG-Protein Interactions for Stable Formulations Studied by CG-MALS

Význam tématu

Mnohé terapeutické proteiny, zejména protilátky, vykazují při koncentracích typických pro finální formulace (> 10 mg/mL) nespecifické samoodpuzování i sdružování. Tyto procesy negativně ovlivňují rozpustnost, stabilitu a viskozitu přípravků. Přídavek excipientu, který se preferenčně váže na povrch monomeru, může snížit vzájemné interakce protein–protein, zvýšit kolloidní stabilitu a umožnit přípravu vysoce koncentrovaných formulací.

Cíle a přehled studie

Tato práce se zaměřuje na kvantifikaci nespecifických interakcí lysozymu a PEG v prostředí modelové formulace (PBS) v koncentracích typických pro bioterapeutika. Pomocí metody CG-MALS byly určeny osmózní virialní koeficienty, stechiometrie komplexů i disociační konstanty interakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda byla založena na Composition-Gradient Multi-Angle Static Light Scattering (CG-MALS), která umožňuje souběžné měření samointerakcí proteinu i hetero-interakcí s PEG v roztoku.

• Wyatt DAWN HELEOS multi-angle static light scattering detector
• Wyatt Calypso II composition gradient system a software
• Optilab T-rEX dRI concentration detector
• Wyatt Möbiuζ pro elektrosforetickou světelnou disperzi

Hlavní výsledky a diskuse

Lysozym se při pH 7,4 a fyziologickém složení soli reverzibilně sdružuje do homodimerů s disociační konstantou KD = 4,4 mM a kladným A2, což odráží sterické odpudivé síly. PEG samotný vykazuje čistě odpudivou interakci odpovídající vyloučenému objemu. Křížový virialní koeficient A11 = 1,6·10⁻⁴ mol·mL/g² je výrazně nižší než teoretické A11exc ≈ 2·10⁻³ mol·mL/g², což indikuje přitažlivost mezi PEG a lysozymem. PEG nekonstituuje komplexy s monomery lysozymu, ale vytváří slabě vázané 2:2 komplexy s dimery (KD ≈ 1 mM). Při koncentracích PEG do ~25 mg/mL dochází ke stabilizaci dimeru, při vyšších koncentracích nastává rychlá hetero-agregace pravděpodobně elektrostatického či dipólového původu.

Přínosy a praktické využití metody

CG-MALS poskytuje:

• Label-free a immobilizaci nepotřebující analýzu
• Určení absolutní stechiometrie a afinity (KD) v rozsahu sub-nM až mM
• Simultánní vyhodnocení samosdružování i hetero-interakcí
• Možnost studia multivalentních komplexů a více proteinských systémů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace excipientů pro různé bioterapeutické proteiny
• Screening formulací a analýza stability v rané fázi vývoje
• Studium komplexních systémů (bispecifické protilátky, chimerické proteiny)
• Integrace CG-MALS s dalšími spektroskopickými a termodynamickými metodami

Závěr

Studie prokázala, že PEG v nižších koncentracích stabilizuje lysozym dimery, zatímco vyšší koncentrace vedou k hetero-agregaci. CG-MALS se ukázala jako klíčový nástroj pro kvantitativní charakterizaci interakcí v koncentrovaných proteinových formulacích.

Reference

1. Furness RB et al. Biomaterials. 1998;15(16):1361–1369.
2. Rawat P et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010;398(3):---