An improved EasyPep sample preparation method for enrichment and quantitation of host cell proteins

Význam tématu

Monitorování hostitelských buněčných proteinů (HCP) v biotechnologických výrobcích je nezbytné pro zajištění bezpečnosti a kvality léčiv. Nízké koncentrace HCP ve srovnání s vysokou hladinou cílové protilátky představují pro analytické metody LC-MS/MS velkou výzvu v podobě širokého dynamického rozsahu.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na vývoj a ověření modifikovaného postupu přípravy vzorků EasyPep obohaceného o depleci proti protein A a částečnou tryptickou eluci. Cílem bylo zlepšit obohacení a kvantifikaci HCP z přebytku terapeutické protilátky. Porovnány byly čtyři workflows včetně nativního digestu a deplece a dále byla vyvinuta cílená PRM metoda pro 28 vysoce rizikových HCP z CHO buněčné linie.

Použitá metodika a instrumentace

• Deplece protilátkou protein A na magnetických perličkách, následná semi-tryptická eluce trypsinem
• Digestion pomocí EasyPep MS sample prep kitu
• Příprava standardních křivek heavy AQUA peptide mixem (Thermo Scientific) a Pierce PRTC
• Kapalinová chromatografie na Dionex UltiMate 3000 RSLCnano spojená s Q Exactive Plus a Stellar MS platformou
• Analýza dat v Proteome Discoverer 3.0 a Skyline, retence predikována softwarem Prosit

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda s deplecí protein A a semi-tryptickou elucí vykázala nejvyšší počet identifikovaných HCP – až dvojnásobek oproti nativnímu digestu. Kvantifikace pomocí PRM prokázala nejnižší hodnoty LOD a LOQ u této upravené EasyPep přípravy. Experimentální diluční křivky ukázaly vysokou linearitu i při velmi nízkých koncentracích analyzovaných peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Díky efektivní depleci protilátky a tryptické eluci je možné přesněji sledovat kritické HCP ve všech fázích purifikačního procesu monoclonálních protilátek. Metoda zvyšuje citlivost a spolehlivost kvantitativních analýz v QA/QC laboratorích a zkracuje dobu od výsledku ke kontrole kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrované automatizované platformy pro přípravu vzorku s minimální manuální manipulací
• Rozšíření panelu sledovaných HCP při použití nových multiplexovaných MS technologií
• Využití strojového učení pro přesnější predikci retence a optimalizaci metod
• Real-time monitoring HCP v průběhu výroby biopotravin a výroby rekombinantních proteinů

Závěr

Modifikovaný EasyPep protokol s deplecí proti protein A a částečnou tryptickou elucí významně zlepšuje identifikaci a kvantifikaci HCP ve srovnání s konvenčními metodami. Vyvinutá PRM metoda poskytuje vysokou citlivost a spolehlivost pro rutinní kontrolu kvality biotechnologických produktů.

Reference

1. Jones et al. High-risk host cell proteins HCPs A multi-company collaborative view. Biotechnol Bioeng. 2021 Aug;118(8):2870-2885.
2. Pino et al. Matrix-Matched Calibration Curves for Assessing Analytical Figures of Merit in Quantitative Proteomics. J Proteome Res. 2020;19(3):1147-1153.
3. Heil et al. Comparison of Unit Resolution Versus High-Resolution Accurate Mass for Parallel Reaction Monitoring. J Proteome Res. 2021;20(9):4435-4442.