Residual host cell protein analysis of NISTmAb: From simplified sample preparation to reliable results

Význam tématu

Analýza zbytkových proteinů z hostitelských buněk je klíčová pro bezpečnost a účinnost monoklonálních protilátek. Regulace požaduje odstranění HCP pod hladinou desítek ppm, přičemž velmi nízké koncentrace jednotlivých HCP mohou stále ovlivnit stabilitu a imunitní odpověď.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ukázat přínos kombinace nedena­turující proteolýzy, vysoce výkonné chromatografie a citlivé HRAM hmotnostní spektrometrie k detekci HCP v rozsahu pod 1 ppm až stovek ppm. Studie popisuje jednoduchou přípravu vzorku, automatizované trávení a pokročilé zpracování dat.

Použitá metodika a instrumentace

• Trávení nativní mAb pomocí Thermo SMART Digest Trypsin magnetic beads při 37 °C.
• Automatizace na Thermo KingFisher Duo Prime se soft­warem BindIt.
• Peptidová separace na Vanquish Horizon UHPLC s Acclaim VANQUISH C18 kolonkou.
• Detekce na Orbitrap Exploris 480 MS s datově závislou akvizicí (Top15) a MS2 izolační šířkou 4 m/z.
• Analýza dat v Proteome Discoverer 2.4 s uzly Feature Mapper, Precursor Detector a Sequest HT.

Hlavní výsledky a diskuse

Nedena­turující trávení potlačilo rozsah signálů mAb, čímž se zvýšila identifikace nízkoabundantních HCP. V replikách bylo identifikováno přes 80 HCP se třemi a více unikátními peptidy, včetně proteinů s koncentrací pod 0,5 ppm i nad 200 ppm. Použití širšího MS2 izolačního okna vedlo k vyšší četnosti chimerických spekter a nová Precursor Detection funkce zvýšila celkový výtěžek identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost pro široké spektrum HCP bez potřeby specifických ELISA reagentů
• Rychlá a opakovatelná příprava vzorku vhodná pro in-process kontrolu
• Detailní profilování HCP v jednom LC-MS běhu s vysokou důvěrou identifikací

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na datově nezávislý sběr (DIA) a iontovou mobilitu
• Automatizace a škálovatelnost pro rutinní kontrolu výrobních šarží
• Využití v on-line monitoringu procesů a v pokročilých bioinformatických platformách

Závěr

Popsaná workflow kombinuje nedena­turující trávení, výkonnou UHPLC, citlivou HRAM-MS a moderní software k robustní a vysoce citlivé analýze HCP. Metoda umožňuje identifikovat a kvantifikovat zbytkové hostitelské proteiny v rozsahu pod 1 ppm až stovek ppm s vynikající reprodukovatelností.

Reference

• Residial Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals. USP General Chapter 1132.
• Fengqiang W et al. Host-Cell Protein Measurement and Control. BioPharm International 2015;28(6):32-38.
• Füssl F et al. Comprehensive Characterisation of the Heterogeneity of Adalimumab via Charge Variant Analysis. mAbs 2019;11(1):116–128.
• Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. ICH Q6B.
• Huang L et al. A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies. Anal Chem 2017;89(10):5436–5444.
• Paschke C et al. Optimizing the Isolation Width in Orbitrap Instruments. Thermo Fisher Poster 65545;2019.
• Doneanu CE et al. Enhanced Detection of Low-Abundance HCP Impurities Down to 1 ppm Using Ion Mobility. Anal Chem 2015;87:10283–10291.