Simultaneous quantitation and discovery (SQUAD) of fecal bile acids and their conjugates in children with autism spectrum disorder (ASD)

Význam tématu

Střevní mikrobiota přetváří primární žlučové kyseliny na sekundární a mikrobně konjugované deriváty, které ovlivňují imunitu, metabolismus lipidů a střevně–mozkovou komunikaci. U dětí s poruchami autistického spektra (ASD) jsou dysbalance mikrobioty a žlučových kyselin spojovány s gastrointestinálními potížemi a neurovývojovými příznaky. Detailní analýza těchto metabolitů je proto klíčová pro porozumění patofyziologii a vyhodnocení terapeutických přístupů založených na modulaci mikrobiomu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit jednovstřikovou SQUAD (Simultaneous Quantitation And Discovery) workflow pro současnou kvantifikaci i objevnou metabolomiku žlučových kyselin ve vzorcích stolice dětí s ASD podstupujících mikrobiální transferovou terapii (MTT). Metodu aplikovali na fecální extrakty z před a po MTT a sledovali změny profilu žlučových kyselin a dalších metabolit.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky stolice se extrahovaly v methanol–vodním systému s vnaděním izotopově značenými standardy žlučových kyselin pro přesnou kvantifikaci.

Data akvizice:

• Cílená kvantifikace: paralelní monitorování reakcí (PRM) v lineárním iontovém pastu s MSn pro rozlišení izomerů.
• Objevná analýza: high–resolution MS1 ve vysokém rozlišení v Orbitrapu pro anotaci neznámých složek.
• Workflow zahrnoval Real–Time Library Search (RTLS) pro zlepšení spektroskopické shody.

Použitá instrumentace

• LC systém: Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC se zpětně fázovou kolonkou.
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid (kvadrupól + lineární iontový past + Orbitrap).
• Software: TraceFinder 5.2 pro kvantifikaci a Compound Discoverer 3.4 pro anotaci.

Hlavní výsledky a diskuse

SQUAD workflow dosáhlo vysoké citlivosti (LLOQ 1,8 femtomolu, LLOD 1,8 attomolu) a lineárního rozsahu přes šest řádů velikosti. Kalibrační křivky pro žlučové kyseliny prokázaly reprodukovatelnost a přesnost kvantifikace. Po MTT byly patrné specifické změny profilu žlučových kyselin, potvrzené PCA, která jasně oddělila před a po terapii v léčebné skupině, zatímco placebo skupina se nijak neměnila. K rozlišení strukturálních izomerů (např. leucinové vs. isoleucinové konjugáty LCA) byla úspěšně použita MS3 fragmentace v lineárním iontovém pastu, prokazující vysokou selektivitu bez vzájemného rušení.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje současnou, vysoce průtokovou kvantifikaci definovaných žlučových kyselin a objevnou analýzu neznámých metabolitů v jedné injekci. To zvyšuje laboratorní efektivitu, redukuje spotřebu vzorků a podporuje komplexní biomarkerový výzkum v klinických i průmyslových aplikacích QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Prohloubená interpretace cest metabolizmu žlučových kyselin v souvislosti s klinickými parametry ASD.
• Aplikace SQUAD na další biologické matice (krev, moč) a onemocnění spojená s dysbiózou.
• Integrace s metagenomikou a dalšími multiomickými přístupy pro komplexní pohled na host–mikrobiota interakce.
• Vylepšení knihoven spekter a RTLS pro rychlejší identifikaci vzácných nebo dosud neznámých derivátů.

Závěr

Vyvinutá SQUAD workflow pro simultánní kvantifikaci a objevnou analýzu žlučových kyselin ve fecesu prokázala vysokou citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost. Umožňuje detailní sledování metabolických změn v terapiích modulujících mikrobiotu a přispívá k identifikaci nových biomarkerů v ASD i jiných onemocněních.

Reference

• Takyi K. et al. Gut microbiota and metabolic imbalances linked to GI and neurodevelopmental issues in ASD. 2025.