Confident transformation site localization of PROTAC drug metabolites facilitated by multi-stage fragmentation LC-HRAM-MS

Význam tématu

Výzkum metabolitů PROTAC molekul je klíčový pro pochopení jejich ADME vlastností, optimalizaci farmakokinetiky a minimalizaci možných toxických účinků. Detailní lokalizace transformačních míst pomáhá navrhovat odolnější výrobky s vyšší účinností a bezpečností.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo přímo a přesně určit metabolické produkty dvou reprezentativních PROTAC sloučenin (MZ1 a dBET1) inkubovaných s lidskou jaterní S9 frakcí. Pomocí flexibilního MSn akvizičního režimu se sledovalo vytváření a lokalizace oxidativních i dealkylačních produktů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky MZ1 a dBET1 (5 µM) byly inkubovány v lidské jaterní S9 frakci za přítomnosti NADPH po dobu 0 a 4 hodin. Po ukončení reakcí acetonitrilem následovalo centrifugování a UHPLC separace na Vanquish Horizon systému s Accucore C18 kolonkou. Spektrální data byla získána na Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid MS v pozitivním režimu za použití AcquireX Background Exclusion a MSn rozhodovacího stromu (MS2-CID/HCD, MS3-HCD). Interpretace proběhla ve Compound Discoverer 3.3 SP3.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo identifikováno 24 metabolitů MZ1 a 13 metabolitů dBET1 s relativním výskytem nad 1 % matričního signálu. U MZ1 dominovalo štěpení ethylenglykolového linkeru, zatímco linker dBET1 prokázal vyšší odolnost. MS3 spektra významně snížila nejednoznačnost při lokalizaci oxidativních změn u izomerických produktů a molekul vyšší hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Přesná lokalizace biotransformačních míst usnadňuje design stabilnějších PROTAC struktur.
• Flexibilní MSn akvizice zajišťuje vysokou datovou hustotu a možnost adaptace v reálném čase.
• Workflow ve Compound Discoverer umožňuje rychlou kombinaci cílené a nekontroly metody pro komplexní metabolomickou analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace strojového učení pro predikci metabolických drah, rozšíření MSn kapacit pro vyšší pořadí fragmentací a kombinace s ion mobility spektrometrií přinesou ještě detailnější pohled na metabolismus PROTAC látek. Zvýšení automatizace a rychlosti analýzy podpoří screening širších knihoven kandidátů.

Závěr

Studie demonstrovala, že multi-stage fragmentace na Orbitrap Ascend MS v kombinaci s rozhodovacím stromem a softwarem Compound Discoverer poskytuje robustní nástroj pro detailní lokalizaci a charakterizaci PROTAC metabolitů. Tím se otevírají nové možnosti optimalizace těchto slibných terapeutik.

Reference

1. Hu Z., et al. Recent Developments in PROTAC-mediated Protein Degradation: From Bench to Clinic. Chembiochem. 2022;23:e202100270. doi:10.1002/cbic.202100270.
2. Goracci L., et al. Understanding the Metabolism of Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs): The Next Step toward Pharmaceutical Applications. J. Med. Chem. 2020;63(20):11615–11627. doi:10.1021/acs.jmedchem.0c00793.