Confident transformation site localization of PROTAC drug metabolites facilitated by multi-stage fragmentation LC-MS

Význam tématu

Studium metabolismu léků je klíčové pro vývoj nových terapeutik, optimalizaci farmakokinetických vlastností a včasnou identifikaci potenciálních toxických metabolitů. PROTAC molekuly představují nový přístup vedoucí k degradaci cílových proteinů, avšak jejich velké a heterogenní struktury komplikují identifikaci míst biotransformací. Využití vysoce citlivé a selektivní LC-MSn metody umožňuje detailní profilování metabolitů i při nízké hladině detekce.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat použití inteligentně řízené multi-stage (MSn) fragmentační akvizice na Orbitrap™ Ascend Biopharma Tribrid™ hmotnostním spektrometru pro lokalizaci transformačních míst u modelových PROTAC sloučenin (MZ1, dBET1) po in vitro inkubaci s lidským jaterním S9 frakcí. Workflow zahrnovalo vygenerování očekávaných metabolitů a automatizovanou analýzu ve software Compound Discoverer™.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: Modelové léky MZ1 a dBET1 (1 mM v DMSO), inkubace s lidskou jaterní S9 frakcí (1 mg/mL) v 100 mM fosfátovém pufru (pH 7,4) při 37 °C, spuštění reakcí NADPH (1 mM), ukončení po 0 a 4 hodinách aketonitrilem.
• UHPLC: Vanquish™ Horizon, kolona Accucore™ C18 (2,1 × 100 mm, 2,6 μm), gradient 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě vs. 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu, průtok 0,4 mL/min, teplota kolony 45 °C.
• MS: Orbitrap™ Ascend Biopharma Tribrid™ s H-ESI zdrojem, TopSpeed ddMSn akvizice (0,8 s cyklus), MS2-HCD pro <500 Da a MS2-CID + MS3-CID/HCD pro >500 Da, EASY-IC kalibrace, AcquireX inteligentní pozadí.
• Software: Xcalibur™ 4.7 pro akvizici, AcquireX Workflow pro vyloučení pozadí, Compound Discoverer™ 3.3 SP3 s uzlem Expected Metabolite ID a FISh scoring pro automatickou anotaci fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikováno 24 metabolitů pro MZ1 a 12 metabolitů pro dBET1. MZ1 se primárně metabolizoval štěpením ethylenglykolového linkeru, zatímco dBET1 podléhal hlavně oxidaci a ring opening hydrolytické dekarboxylaci.
• Příklad metabolitu M14 (m/z 532,18) demonstroval lokalizaci štěpení linkeru z MS2 dat a FISh anotací.
• Oxidovaný metabolit M18 (m/z 1017,36) umožnil díky MS3 spektru přesné určení oxidačního místa na BRD4 ligandu, zatímco M23 prokázal oxidaci na linkeru.
• Regioizomery dBET1+H2O (M7, M8) bylo možné odlišit na základě MS2 spekter hydrolyzovaných kruhů.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost spolehlivé detekce a strukturální elucidace nízkokoncentrovaných PROTAC metabolitů.
• Inteligentní akvizice AcquireX maximalizuje relevantní fragmentační data a minimalizuje potřebu cílených re-akvizic.
• Automatizované anotace ve Compound Discoverer zrychlují a zpřesňují identifikaci metabolitů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na další heterobifunkční molekuly a komplexní biologické matric.
• Integrace dat MSn s in silico predikcí metabolitů pro prediktivní soft-spot analýzu.
• Využití automatizovaných workflow a umělé inteligence pro rychlé vyhodnocení farmakokinetických profilů.

Závěr

Kombinace vysokého rozlišení a multi-stage fragmentace na Orbitrap Ascend Biopharma Tribrid a inteligentní akvizice s následnou analýzou v Compound Discoverer umožňuje důkladné profilování a lokalizaci biotransformačních míst u PROTAC sloučenin. Metoda přináší zvýšenou citlivost, efektivitu a přesnost při studiu metabolismu složitých terapeutických molekul.

Reference

1. Hu Z. et al. Recent Developments in PROTAC-mediated Protein Degradation: From Bench to Clinic. Chembiochem. 2022;23:e202100270. doi:10.1002/cbic.202100270
2. Goracci L. et al. Understanding the Metabolism of Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs): The Next Step toward Pharmaceutical Applications. J Med Chem. 2020;63:11615. doi:10.1021/acs.jmedchem.0c00793
3. Comstock K., Du M., Jiang M. Confident drug metabolite identification using an intelligent data acquisition and processing workflow. Thermo Fisher Scientific Application Note 65953. 2021.