Evaluation of new high pH stable, superficially-porous particle columns for the reversed-phase separation of oligonucleotides

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy se uplatňují jako nový typ terapeutik, ale během výroby vznikají nežádoucí N−1 a N−2 produkty, které vyžadují rychlé a vysoce rozlišené analytické metody. Vysoké pH a teploty mobilní fáze v reverzní fázi kladou nároky na chemickou stabilitu kolon.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo otestovat nové povrchově porézní částice stabilní při vysokém pH pro separaci oligonukleotidů a porovnat je s tradičními plně porézními částicemi z hlediska rychlosti, rozlišení a stability.

Použitá metodika a instrumentace

Reverzní fázová HPLC se stacionární fází C18 na povrchově porézních částicích AdvanceBio Oligonucleotide (2,7 µm). Mobilní fáze A: 100 mM TEAA/voda, B: 100 mM TEAA/ACN. Gradienty optimalizované pro RNA i DNA oligonukleotidy. Pro LC/MS kompatibilní metodu byl použit systém HFIP:TEA v kombinaci s methanolem. Analýza proběhla na Agilent 1290 Infinity Binary, detekce UV 260 nm, teplota kolony 65 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

• Povrchově porézní kolony vykázaly užší šířku píků a rychlejší hmotový přenos než plně porézní 1,7 µm částice.
• RNA oligonukleotidy (20–21 mer) byly separovány s blízkým baseline rozlišením během 10 minut.
• DNA oligonukleotidy (15–40 mer) byly rozděleny na základě délky do 10 minut, 15-mer elutoval již za 2 minuty.
• Kolony si udržely konzistentní retenci hlavního píku i nečistot až po 300–400 injekcích, a to při pH > 8.
• Provozní tlak na 2,7 µm sloupci byl výrazně nižší, kompatibilní s 600 i 1200 bar systémy.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a vysoce rozlišené testy pro QC laboratoře v biotechnologii a farmaceutickém výzkumu.
• Robustnost sloupců při vysokém pH zaručuje dlouhou životnost a minimální změnu retence.
• Kompatibilita s LC/UV i LC/MS zefektivňuje workflow a umožňuje přesné kvantifikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zmenšování částic a využití ultra vysokotlakých chromatografických systémů.
• Širší aplikace pro větší biologické makromolekuly a komplexní polymery.
• Integrace s pokročilou detekcí MS a automatizovanými vyhodnocovacími algoritmy.
• Úpravy povrchové chemie pro selektivnější vazbu a lepší oddělení sekvenčně podobných sekvencí.

Závěr

Nové povrchově porézní kolony AdvanceBio Oligonucleotide prokázaly rychlou a vysoce rozlišenou separaci oligonukleotidů s vynikající stabilitou při vysokém pH a nízkým provozním tlakem. Tyto vlastnosti je předurčují pro široké nasazení v analytické chemii oligonukleotidů.

Reference

• Bidlingmeyer B. A., Wang X., Luke S., Duong P. T. Evaluation of new high pH stable, superficially-porous particle columns for the reversed-phase separation of oligonucleotides. Agilent Technologies HPLC 2015, PSB-BIOAN-07.