Fast and High-Resolution Reversed-Phase Separation of Synthetic Oligonucleotides

Význam tématu

Analýza syntetických DNA a RNA oligonukleotidů je klíčová pro kontrolu kvality bioterapeutik. Vysoká čistota produktů je nezbytná pro zajištění farmakologické účinnosti a minimalizaci vedlejších účinků. Zavedení rychlých a vysoce výkonných chromatografických metod umožňuje laboratorím dosahovat spolehlivých výsledků v nejkratším čase.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo ukázat možnost rychlé a vysoce efektivní separace deprotected DNA a RNA oligonukleotidů pomocí pH-stabilních, superficially porous C18 kolon Agilent AdvanceBio Oligonucleotide. Studie porovnává dvě chromatografické módy (LC/UV a LC/MS) a hodnotí separační schopnosti, kompatibilitu s MS a dlouhodobou stabilitu kolon.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá reverzní fázi s částicemi Poroshell o velikosti 2,7 µm na sloupcích 2,1 × 50 mm. Pro LC/UV se aplikují mobilní fáze: A) 100 mM triethylammonium octanu (TEAA) ve vodě, B) 100 mM TEAA v acetonitrilu, se zónovým gradientem. Pro LC/MS je použit systém HFIP:TEA v poměru 400 mM : 15 mM ve vodě a methanol:vodný HFIP:TEA (50 : 50). Teplota kolony je 65 °C, detekce UV 260 nm a MS v negativním módu na rozsahu 400–1700 m/z.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC
• Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS

Hlavní výsledky a diskuse

Separační výkon byl demonstrován na standardních sadách oligonukleotidů:

• Řešení RNA standardu (14–21 mer) s kompletním baseline rozlišením do 9 min.
• Řešení DNA žebříčku (15–40 mer) s pěti až osmiminutovým během a jasně oddělenými píky.
• MS kompatibilita pro 25-mer DNA za tři minuty, s přesnou detekcí hlavního píku i N-1 a N-2 nečistot.
• Deconvoluted data potvrdila 100% hmotnostní návratnost na kolonu.
• Porovnání s 1,7 µm hybridním C18 ukázalo užší píky a nižší difúzní vzdálenosti pro superficially porous částice, přičemž tlak byl o více než 60 % nižší (108 vs. 292 bar).
• Studie stability naznačila vysokou reprodukovatelnost retenčních časů (přes 400 injekcí) a dlouhou životnost kolony.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Výrazné zkrácení doby analýzy oproti aniontové výměnné chromatografii bez kompromisů v rozlišení.
• Kompatibilitu s vysokopH eluentními systémy vhodnými pro UV i MS detekci.
• Vysokou propustnost vzorků pro rutinní kontrolu kvality syntéz v biotechnologii a farmaceutickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této technologie:

• Integrace s UHPLC systémy vyšších tlaků (>1200 bar) pro další zrychlení analýz.
• Aplikace na modifikované nebo konjugované oligonukleotidy a jejich metabolity.
• Rozvoj miniaturizovaných a automatizovaných platform pro paralelní zpracování více vzorků.

Závěr

AdvanceBio Oligonucleotide kolony na bázi superficially porous částic představují robustní a rychlý nástroj pro vysokou chromatografickou efektivitu a rozlišení syntetických DNA/RNA oligonukleotidů. Díky vysoké pH stabilitě a kompatibilitě s MS nabízí univerzální řešení pro QA/QC i výzkumné aplikace.