Efficient Reversed-Phase Separation of Oligonucleotides by Using High pH Stable Superficially Porous Columns

Význam tématu

Oligonukleotidy jako terapeutika vyžadují rychlé a vysoce rozlišovací analytické metody, protože syntéza generuje často produkty s jedním nebo dvěma chybějícími nukleotidy. Reversed-phase HPLC při základním pH a zvýšené teplotě vyžaduje chemicky odolné kolony. Nové vysokopH stabilní povrchově porézní částice nabízejí zlepšenou hmotnostní výměnu a nižší protitlak než tradiční plně porézní materiály.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na hodnocení výkonu sloupců AdvanceBio Oligonucleotide (2,1×50 mm, 2,7 μm povrchově porézní částice) při separaci RNA a DNA oligonukleotidů. Cílem bylo porovnat rozlišení, šířku píků a tlak s konkurenčním 1,7 μm C18 materiálem a ověřit stabilitu kolony při 300 opakovaných injekcích.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolona: AdvanceBio Oligonucleotide 2,1×50 mm, 2,7 μm
• Mobilní fáze A: 100 mM TEAA ve vodě; fáze B: 100 mM TEAA v acetonitrilu (alternativně HFIP/TEA a methanol pro LC/MS)
• Gradient: 10–14 % B za 10 min (RNA); 6–8 % B za 12 min (DNA); rychlé gradienty pro MS-friendly režim
• LC: Agilent 1290 Infinity Binary
• Detekce: UV při 260 nm
• Vzorky: standardy oligonukleotidů (21-, 20-, 25-mer)

Hlavní výsledky a diskuse

• RNA 21-mer a N-1 20-mer dosáhly téměř základního rozlišení; píková šířka byla u povrchově porézního sloupce menší (PW=0,160 min) než u 1,7 μm C18 (PW=0,185 min).
• Protitlak pro 2,7 μm kolonu činil ~108 bar oproti ~292 bar u 1,7 μm; kompatibilita s 600 a 1200 bar systémy.
• DNA ladder standard (6 délek) separovány za méně než 10 min; 15-mer za 2 min, 20- a 25-mer za 4–5 min.
• Stabilita: po 300 injekcích 25-mer DNA zůstaly retence a rozlišení konstantní.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená rychlost a rozlišení díky efektivnější hmotnostní výměně povrchově porézních částic.
• Nižší protitlak umožňuje použití sloupců ve standardních i ultravysoce tlakových systémech.
• Metoda funguje jak pro LC/UV, tak pro LC/MS mobilní fáze, vhodná pro rutinní kontrolu kvality oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj iontově párovacích mobilních fází optimalizovaných pro citlivou detekci hmotnostní spektrometrií. Další trendy zahrnují úpravy povrchů částic pro rychlejší separace a integraci s vysoce výkonnými automatizačními platformami pro vysokoprostorové aplikace.

Závěr

Sloupce AdvanceBio Oligonucleotide založené na povrchově porézních částicích prokázaly vynikající rozlišení, rychlost a stabilitu při separaci RNA a DNA oligonukleotidů. Nabízejí výrazné zlepšení oproti tradičním plně porézním C18 sloupcům, zejména v nižším protitlaku a dlouhodobé odolnosti při vysokopH aplikacích.