High Resolution Mass Spectrometry and LC-UV Data Streams Applied to Characterizing Oligonucleotide Impurities

Význam tématu

Analýza čistoty a sekvenční charakterizace terapeutických oligonukleotidů je klíčová pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti. Přesné stanovení impurit a potvrzení primární struktury zabraňuje nechtěným vedlejším účinkům a zajišťuje shodu s regulačními požadavky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo představení integrovaného přístupu kombinujícího vysoce rozlišenou hmotnostní spektrometrii (HRMS, QTOF) s LC-UV (PDA) a specializovaným softwarem Insight Biologics pro komplexní charakterizaci surových a purifikovaných vzorků oligonukleotidu PS20mer. Studie demonstrovala schopnost metody detekovat full-length produkt i nízkoúrovňové impurity a objasnila rozdíly v kvantifikaci mezi UV a MS detekcí.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Shimadzu Nexera XSTM inertní LC se sloupcem Shim-pack Scepter Claris, iontově párovací činidla.
• Hmotnostní spektrometrie: Shimadzu QTOF LCMS-9050, TOF-MS (m/z 550–2500, negativní iontový mód) a DDA-MS/MS (m/z 100–2800, 10 MS/MS událostí, CE=0,045×m/z–0,15).
• UV detekce: PDA detektor při 260 nm, šířka pásma 4 nm.
• Software: Insight Biologics pro cílovou sekvenční identifikaci, vyhledávání modifikací, výpočet relativní abundancí impurit.

Hlavní výsledky a diskuse

• Surový vzorek PS20mer obsahoval vysoký podíl zkrácených sekvencí (shortmers) a další nízkoúrovňové produkty.
• Purifikace pomocí Contichrom CUBE výrazně snížila počet impurit pod 0,1 % FLP a umožnila detailní sekvenční pokrytí full-length produktu.
• Srovnání LC-UV a HRMS detekce ukázalo rozdíl ve stanovení impurity N-1(C1:G19): 1,346 % (UV) vs. 1,63 % (MS), což odráží zohlednění dalších souvisejících ztrát v MS režimu.
• Lineární UV odezva v koncentracích 0,01–0,6 mg/mL potvrdila robustnost kvantifikace po izolaci čistých komponent.

Přínosy a praktické využití metody

• End-to-end workflow poskytuje rychlou a spolehlivou charakterizaci oligonukleotidů pro QA/QC laboratoře ve farmaceutickém a biotechnologickém sektoru.
• Softwarové řešení Insight Biologics umožňuje identifikaci sekvenčních modifikací, deletů a adicí v jednom analytickém běhu.
• Metoda zajišťuje detailní profil impurit, podporuje rozhodování o purifikaci a optimalizaci výrobních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření softwarových funkcí pro automatické rozpoznávání komplexních modifikací a mezimolekulárních vazeb impurit.
• Integrace s pokročilými iontovými zdroji a multimodálními detektory pro zvýšení citlivosti a rychlosti analýzy.
• Aplikace umělé inteligence a strojového učení pro predikci a automatickou klasifikaci neznámých impurit.

Závěr

Vysoce rozlišená LC-MS/MS QTOF metoda v kombinaci s LC-UV a pokročilým softwarem Insight Biologics představuje robustní end-to-end řešení pro detailní charakterizaci terapeutických oligonukleotidů a jejich impurit. Rozdíly v kvantifikaci mezi UV a MS zdůrazňují potřebu volby vhodné detekční techniky pro přesné vyhodnocení čistoty produktů.

Reference

• Uchiyama K., Kato N., Nomura T. a kol., High Resolution Mass Spectrometry and LC-UV Data Streams Applied to Characterizing Oligonucleotide Impurities, Shimadzu Corporation, 2023.