High-Efficiency Electron Capture Dissociation of Peptides and Proteins After Collision-Induced Unfolding and Ion Mobility

Význam tématu

Analýza biomolekul na úrovni terciární a kvartérní struktury v plynném stavu pomáhá porozumět jejich funkci a vazbám. Kombinace CIU-IM-MS s ECD umožňuje současné získání informací o konformačních změnách a sekvenčním pokrytí proteinu, což rozšiřuje možnosti studia posttranslačních modifikací, disulfidických vazeb i isomerie.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo implementovat a optimalizovat prototypový fly-through ExD cell pro ECD po IM separaci v platformě Agilent 6560C IM-QTOF. Výzkum zahrnoval nastavení CIU, ladění tlaku a elektrooptiky pro dosažení optimální účinnosti ECD při zachování rozlišení IM a posouzení vztahu mezi kolizním průřezem a pokrytím sekvence u různých modelových proteinů a peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Agilent 6560C IM-QTOF s prototypovým ExD cellem umístěným za kolizní buňkou, Agilent nanospray (G1992A) a AJS zdroj (G1958B).
• Metoda: In-source CIU při napětích 20–300 V, driftová trubice pro IM separaci, následné ECD s laděním delta napětí čoček a filament bias.
• Vzorky: Substance P, ubiquitin, cytochrom c, karboanhydráza, NISTmAb v definovaných pufrech (např. 100 mM ammonium acetát).

Hlavní výsledky a diskuse

• Substance P: Dva konforméry se neseparovaly úplně, ale ECD dosáhla 5–10 % účinnosti a identického fragmentačního vzoru.
• Cytochrom c: CIU při 20/150/200 V odhalilo tři konformace (drift 28, 33, 38 ms); sekvenční pokrytí bylo podobné, omezení v okolí vazby na hem.
• Karboanhydráza: U 11+ a 12+ nábojových stavů CIU identifikovalo až pět struktur, uvolnění oblasti 180–210 zvýšilo ECD pokrytí v C-terminálním úseku.
• NISTmAb: Náboje 22–30+ korespondovaly se vzrůstajícím CCS. Šetrné ECD odhalilo fragmenty N-terminu a CDR3 lehkého řetězce, agresivní ECD rozlomila disulfid C23–C87 a rozšířila pokrytí.

Přínosy a praktické využití metody

• Současné získání konformačních i sekvenčních dat v jednom měření.
• Analýza strukturálně odolných domén a modifikací v nativním stavu.
• Využití v proteomice, studiu terapeutických proteinů a QA/QC průmyslové analytiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace ExD cell pro zvýšení účinnosti a rozlišení IM.
• Aplikace na větší proteinové komplexy a membránové proteiny.
• Integrace s dalšími ExD technikami (ETD, EID) a automatizovanou analýzou dat.

Závěr

Kombinace CIU, IM a ECD na platformě Agilent 6560C IM-QTOF s prototypovým ExD cellem nabízí silný nástroj pro detailní charakterizaci struktury a sekvence proteinů a peptidů s vyvážením mezi fragmentační účinností a rozlišením separace.

Reference

• Zhang M. et al. Native electrospray ionization and electron-capture dissociation for comparison of protein structure in solution and the gas phase. Int J Mass Spectrom. 2013;354–355.