Top-down characterization of native monoclonal antibodies obtained with electron capture dissociation on Q-TOF instruments

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu biologických léčiv užívaných v terapii onemocnění od rakoviny po autoimunitní poruchy. Detailní charakterizace jejich struktury a posttranslačních modifikací je zásadní pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti těchto léků. Top-down hmotnostní spektrometrie s využitím elektronové zachycovací disociace (ECD) nabízí přímé rozlišení intactních proteoform a eliminuje nutnost složité přípravy vzorku, přičemž poskytuje cenné informace o sekvenci i strukturních vazbách protilátek.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit schopnost top-down ECD analýzy natívních intactních monoklonálních protilátek (NIST mAb, SigmaMAb, Infliximab) na Q-TOF spektrometrech s instalovanou ExD buňkou a optimalizovat parametry suplementární kolizní aktivace pro zvýšení výtěžnosti fragmentů. Zaměřili jsme se zejména na lokalizaci komplementárních určujících oblastí (CDR), především CDR-3 v těžkém řetězci, a na stanovení sekvenční pokrytí lehkých řetězců.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky intactních protilátek byly po výměně pufru do 100 mM acetátu amonného zaváděny statickou nano­sprejovou metodou při koncentraci 1 mg/ml. Analýzy probíhaly na spektrometrech Agilent 6545 a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s modifikovanými ExD buňkami (e-MSion part of Agilent). Buňka ExD sestávala ze sedmi elektrostatických čoček, dvou magnetických prstenců a emitujícího vlákna, řízeného ExD Control softwarem. Suplementární kolizní energie byla variována od 0 do 200 V, optimálně 100 V. Kalibrace mass-scale proběhla pomocí Agilent tune mix, ladění ExD buňky s použitím Substance P a karbonanhydrázy. Data byly zpracovány v Agilent MassHunter Qualitative Analysis a ExDViewer.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ukázala výrazně vyšší intenzity ECD fragmentů (c- a z-typ) ve srovnání s CID fragmenty (b- a y-typ) napříč celým rozsahem kolizních energií. Intakt­ní těžké řetězce dosáhly 45–50% sekvenčního pokrytí, lehké řetězce 75–90%. U těžkých řetězců byla s vysokou spolehlivostí identifikována zejména CDR-3, zatímco u lehkých řetězců byly lokalizovány všechny tři CDR oblasti. Speciální ladicí profil ExD buňky umožnil selektivní štěpení disulfidických vazeb a uvolnění lehkých řetězců intactních protilátek ve vysokých nábojových stavech.
U SigmaMAb se při ladění pro zvýraznění lehkých řetězců projevila silná konkurence mezi ECD a CID postupy, kdy při vyšších kolizních energiích dominovaly CID fragmenty.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přímá analýza intactních protilátek bez nutnosti denaturace či štěpení na peptidy.
• Vysoce efektivní lokalizace CDR oblastí, klíčových pro vazebnou specifitu a účinnost léčiv.
• Schopnost detekce a lokalizace posttranslačních modifikací a disulfidických vazeb.
• Potenciál pro nasazení v QA/QC laboratořích biotechnologických i farmaceutických společností.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj bude směřovat k integraci techniky ECD s vyšší rozlišovací schopností hmotnostních analyzátorů, k optimalizaci ExD buněk pro vyšší fragmentační výtěžnost a k rozšíření na analýzu komplexních glykoform. Kombinace top-down a middle-down přístupů či online hyphenace s chromatografickými technikami otevře nové možnosti pro detailní charakterizaci protilátek a dalších biologických makromolekul.

Závěr

Top-down ECD analýza intactních monoklonálních protilátek na modifikovaných Q-TOF spektrometrech prokázala vysokou účinnost fragmentace a schopnost lokalizovat klíčové CDR regiony. Suplementární kolizní aktivace na úrovni ~100 V výrazně zlepšila uvolnění fragmentů a sekvenční pokrytí. Metoda nabízí cenný nástroj pro rychlou a detailní kontrolu kvality biologických léčiv.

Reference

• Y. V. Vasil’ev, R. Franklin, M. C. Hare, A. Guthals, J. S. Beckman. Top-down characterization of native monoclonal antibodies obtained with electron capture dissociation on Q-TOF instruments. Poster TP 024, ASMS 2023.