A Three-in-One End-to-End Automated Sample Preparation and LC/MS Metabolomics, Lipidomics, and Proteomics Workflow for Plasma

Význam tématu

Integrace metabolomiky, lipidomiky a proteomiky umožňuje komplexní pohled na buněčné i patologické procesy z malého objemu plazmy.
Automatizovaná end-to-end příprava vzorku zvyšuje reprodukovatelnost, šetří čas i vzorky a usnadňuje standardizaci procesů v laboratoři.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit plně automatizované třífázové workflow pro extrakci metabolitů, lipidů a proteinů z 20 µL plazmy, s následnými speciálními LC/MS metodami pro každou frakci.
Workflow zahrnuje simultánní zpracování jedné plošné destičky a přepínání LC/MS metod na jednom systému.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorků byla realizována na Bravo Liquid Handleru s protokoly VWorks.
Proteinová frakce: tryptická digesce na AssayMap Bravo.
Metabolity a lipidy separovány pomocí Captiva EMR-Lipid destičky (SPE), metabolity v průtoku, lipidy eluovány později.
Analytika:

• Metabolity: HILIC chromatografie, Agilent 6495C LC/TQ
• Lipidy: RP C18 chromatografie, Agilent 6495C LC/TQ
• Proteiny: RP chromatografie, Agilent 6546 LC/Q-TOF

Software: komerční kvantitativní balíky a Spectrum Mill.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metabolomika: detekováno 437 metabolitů; 70 % s %RSD ≤ 10 %, 87 % s %RSD < 20 %.
• Proteomika: automatizovaná extrakce přinesla průměr 1204 peptidů/injekci vs. 1126 při manuálním zpracování (p = 0,0077); medián %CV peptidových signálů 14,1 %.
• Lipidomika: identifikováno 615 lipidů z hlavních tříd; reproducibilita extrakce deuterovaných standardů %RSD Bravo ~ 5–9 %.
• Porovnání 3-in-1 a dřívějšího 2-in-1 workflow ukázalo shodné chromatogramy TIC a konzistentní výsledky frakcí.

Přínosy a praktické využití metody

Standardizované a robustní postupy pro malé objemy plazmy zkracují dobu analýzy a umožňují vyšší propustnost v klinické i výzkumné praxi.
Snížení variability a spotřeby reagencií podporuje rutinní použití ve farmacii, biomarkerovém screeningu i QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření workflow pro další biologické matrice (tkáně, buňky) a integrace s novými generacemi MS přístrojů.
Implementace pokročilých datových analýz včetně umělé inteligence pro hlubší interpretaci omických dat.
Vysokopropustné screeningy a personalizovaná medicína jako klíčová oblast dalšího rozvoje.

Závěr

Předložené třífázové automatizované workflow poskytuje rychlou, reproducibilní a flexibilní platformu pro komplexní omické analýzy z malých objemů plazmy.
Ověřené protokoly a komerčně dostupné nástroje usnadňují implementaci v širokém spektru laboratorních prostředí.

Reference

1. Vande Bittner GC et al. An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow… Agilent Technical Overview 5994-5065EN. 2022.
2. Sartain M et al. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction… Agilent Application Note 5994-2156EN. 2020.
3. Spivia W et al. Automated Metabolite Extraction for Plasma using the Agilent Bravo Platform… Agilent Application Note 5994-0685EN. 2019.
4. Apffel A et al. A Novel Solid Phase Extraction Sample Preparation Method for Lipidomic Analysis… Metabolites, 2021, 11(5): 294.
5. Yannell K et al. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow… Agilent Application Note 5994-5628EN. 2023.
6. Huynh K et al. A Comprehensive, Curated, High-Throughput Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome… Agilent Application Note 5994-3747EN. 2021.
7. Wu L. Peptide Quantification in Plasma Using the Agilent 6495… Agilent Application Note 5994-2285EN. 2020.