Large Panel Targeted Proteomics for Low-amount Samples Using an Enhanced Nanoflow 6495D LC/TQ System

Význam tématu

Cílená proteomika s vysokou citlivostí je klíčová pro analýzu vzorků s nízkým množstvím proteinů, včetně single cell proteomu. Precizní a přesná kvantifikace umožňuje objev biomarkerů a hloubkovou charakterizaci proteinových sítí na úrovni jednotlivých buněk.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat nanoflow LC/TQ systém pro rozsáhlé panelové cílené proteomické analýzy nízko množných vzorků. Kombinací Evosep One LC, modifikovaného Newomics UniESI iontového zdroje a Agilent 6495D triple kvadrupolu autoři vyvinuli workflow pro kvantifikaci až 1000 proteinů bez použití těžkých izotopových standardů.

Použitá instrumentace

• Evosep One nanoflow LC
• Newomics UniESI 2.0 iontový zdroj
• Agilent 6495D triple kvadrupolový LC/MS
• Agilent AssayMAP Bravo platforma
• IonOpticks Aurora Elite XT kolona (15 cm x 75 μm, 1.7 μm C18)

Použitá metodika

Workflow zahrnovalo:

1. Vytvoření dMRM metody v Skyline (1 peptide/protein, 8 přechodů)
2. Bez použití stabilních izotopových standardů
3. Optimalizace retenčních časů a kolizních energií pomocí endogenních referenčních peptidů
4. Analýza sérií naředění K562 proteomového standardu (31.25 pg–64 ng)

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekce 1000 proteinů s celkem 7942 dMRM přechody
• 98.5 % shoda retenčních časů mezi MRM a DDA potvrzuje vysokou přesnost
• Střední CV plošného signálu peptidek dosáhl 7.5 % pro 64 ng
• Lineární kalibrace umožnila kvantifikaci od 31.25 pg on-column (R2 > 0.99), odpovídající single cell úrovni

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí kombinaci vysoké selektivity, citlivosti a propustnosti, vhodnou pro objevy proteinových biomarkerů v klinických a výzkumných aplikacích bez nutnosti nákladných izotopových standardů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace stabilizovaných izotopů pro další zlepšení kvantifikace
• Automatizace přípravy vzorků a rozšíření analýzy na posttranslační modifikace
• Hlubší proteomické pokrytí a aplikace ve single cell proteomice

Závěr

Implementace vylepšeného nanoflow LC/TQ systému výrazně zlepšuje kvantitativní analýzu nízkých množství proteinů. Studie prokázala, že vyvinuté workflow je rychlé, ekonomické a schopné detekovat proteiny na úrovni single cell bez použití izotopových standardů.

Reference

• A Rapid and Economical Workflow for Protein Biomarker Discovery Using Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS System