Top-Down CDR Sequencing of Native Intact mAbs Through Deconvolution of HC+LC Mixture Spectra

Význam tématu

Top-down sekvenování CDR oblastí intaktních monoklonálních protilátek (mAb) pomocí elektronové zachytávací disociace (ECD) umožňuje přímé ověření variabilních regionů bez nutnosti enzymatické digestu a chemické redukce. Tato metoda minimalizuje artefakty spojené se zpracováním vzorku a nabízí rychlou kontrolu kvality pro QA/QC, biofarmaceutický výzkum a vývoj.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat dekonvoluci směsného spektra fragmentů těžkého řetězce (HC) a lehkého řetězce (LC) intaktní mAb pomocí ECD na Q-TOF přístroji a ověřit automatizované přiřazování iontů i v oblastech s jejich překryvem. Studie představuje algoritmus Ion Matchmaking pro zvýšení přesnosti přiřazení k CDR doménám.

Použitá instrumentace

Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF mass spectrometer upravený druhou generací ExD buňky pro ECD
Static nanospray pro přívod nativních mAb roztoků (1 mg/ml v 100 mM amonium acetátu)
ExDViewer freeware pro analýzu, dekonvoluci a vizualizaci fragmentačních dat

Použitá metodika

Vzorek NIST mAb byl dialyzován do roztoku 100 mM amonium acetátu pomocí 10 kDa filtrů. MAb byly infundovány statickou nanosprayi přímo do ECD upraveného Q-TOF. Spektra byla zaznamenána v MS1 režimu s dolní hranicí konkurentních iontů cca m/z 4000 a přídavnou kolizní energií 100 V pro zvýšení fragmentace. Data byla zpracována ExDViewer s výchozími parametry pro výběr špiček, dekonvoluci a volitelným Ion Matchmakingem.

Hlavní výsledky a diskuse

Ion Matchmaking algoritmus výrazně snížil počet falešných přiřazení iontů překrývajících CDR3 domény HC a LC.
Dosahovaná krytí proměnných regionů CDR:

• HC: 45–50 % fragmentů v proměnném regionu, s vysokou jistotou zejména v CDR3
• LC: 75–85 % fragmentů, kompletní pokrytí všech tří CDR

Překrývající se izotopové shluky mezi HC a LC byly efektivně rozlišeny, což umožnilo rychlou manuální verifikaci na základě konzistentních c-iontů o nábojích 3–6+.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé top-down ověření CDR sekvencí přímo z intaktních mAb bez enzymatického štěpení a chemických modifikací. Uplatnění nachází v biopharmaceutickém vývoji, kontrole kvality výrobních šarží a při validaci struktury terapeutických protilátek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se očekává v oblasti integrace s UVPD a dalšími ExD technikami, zlepšení softwarové automatizace analýzy směsných spekter a rozšíření na další biologické makromolekuly. Vývoj datových kubů pro strojové učení může zvýšit citlivost a rychlost verifikace.

Závěr

Top-down ECD fragmentace intaktních mAb ve spojení s Ion Matchmakingem v ExDViewer poskytuje spolehlivou a rychlou cestu k přesnému sekvenování CDR oblastí. Metoda minimalizuje artefakty vzorkové přípravy a nabízí robustní platformu pro rutinní QA/QC analýzu terapeutických protilátek.

Reference

• Shaw JB et al. Anal Chem. 2020;92(1):766–773. doi:10.1021/acs.analchem.9b03129
• Vasilev YV et al. ASMS 2023
• Agilent ExDViewer End User License Agreement, exdviewer.agilent.com