Estimating protein partitioning in multicomponent aqueous two-phase extraction based on CG-MALS measurements

Význam tématu

Analytika proteinů v prostředí vícekomponentních vodných dvoufázových systémů (ATPS) je klíčová pro efektivní izolaci a purifikaci bioterapeutik. Precizní odhad distribuce a precipitace cílového proteinu (IgG) umožňuje minimalizovat rozsáhlé experimentální skríningy a urychlit procesní vývoj v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo zavést novou metodu predikce partitioningu imunoglobulinu G (IgG) v systému PEG–fosfát založenou na měření osmotických virialních koeficientů B22 (protein–protein interakce) a B23 (protein–solute interakce) pomocí kompozicionálně gradientního víceúhlého laserového rozptylu (CG-MALS). Dále se hodnotil vliv NaCl a (NH₄)₂SO₄ jako displace­mentních činidel na chování IgG.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Měření B22 pomocí statického světelného rozptylu (SLS) na DAWN MALS.
• Určení indexu lomu dn/dc pro protein a soluty differenčním refraktometrem Optilab.
• Výpočet B33 pro malé soli z literárních hodnot osmotic­kých koeficientů.
• Stanovení B23 pomocí CG-MALS s variací koncentrací IgG (c2) a displace­mentních solí (c3) a fitováním příslušné rovnice.

Instrumentace:

• Calypso® kompozicionálně gradientní systém (Wyatt Technology)
• Optilab® differenční refraktometr
• DAWN multi-angle light scattering (MALS)
• Software CALYPSO™ pro řízení experimentu a analýzu dat

Hlavní výsledky a diskuse

• B22 pro IgG ve 0,05 M fosfátovém pufru (pH 7, 25 °C) se zvyšující se koncentrací NaCl a (NH₄)₂SO₄ klesá (hodnoty záporné), což signalizuje rostoucí atraktivní protein–protein interakce a vyšší tendency k precipitaci.
• B23 ukázaly silné repelentní interakce IgG s NaCl a (NH₄)₂SO₄, což předpovídá schopnost těchto solí dislokovat IgG z fosfátové fáze do fáze PEG.
• Validace v ATPS (7 % PEG 2000 + 14 % fosfát, pH 7, 25 °C):
  
  • Bez soli K_IgG ≈ 0,09 (převážně dolní fáze).
  • S 5 % NaCl K_IgG ≈ 1,18; s 10 % NaCl K_IgG ≈ 38,5.
  • S 2 % (NH₄)₂SO₄ K_IgG ≈ 1,08.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení počtu empirických skríningových experimentů v ATPS vývoji.
• Rychlá kvalifikativní predikce precipitace a distribuce proteinu.
• Možnost cíleného výběru displace­mentních solí minimalizující ztráty proteinu.
• Přímá přizpůsobitelnost existujících nástrojů pro průmyslové škálování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření přístupu na různé třídy proteinů a polymery pro tvorbu ATPS.
• Integrace s modelováním molekulárních interakcí a strojovým učením pro automatizované navrhování systémů.
• Vysokopropustné platformy CG-MALS pro paralelní měření desítek kombinací fází a displace­mentů.
• Implementace v kontinuálních procesech downstream processingu.

Závěr

Přístup založený na osmotic­kých virialních koeficientech B22 a B23 měřených CG-MALS poskytuje spolehlivou a efektivní strategii predikce partitioningu a precipitace IgG v PEG–fosfátových ATPS. Kombinace experimentálních měření a výpočtů snižuje náročnost procesního designu a umožňuje cílený výběr displace­mentních solí při zachování integrity proteinu.

Reference

1. Albertsson, P.-Å. Particle fractionation in liquid two-phase systems: Biochimica et Biophysica Acta 27, 378–395 (1958).
2. Asenjo, J. A. & Andrews, B. A. Aqueous two-phase systems for protein separation: Journal of Chromatography A 1218, 8826–8835 (2011).
3. Bonneté, F., Finet, S. & Tardieu, A. Second virial coefficient: Variations with lysozyme crystallization conditions: Journal of Crystal Growth 196, 403–414 (1999).
4. Johansson, G. Aqueous two-phase systems in protein purification: Journal of Biotechnology 3, 11–18 (1985).
5. Johnson, C. S. & Gabriel, D. A. Laser light scattering. Dover (1994).
6. King, R. S., Blanch, H. W. & Prausnitz, J. M. Molecular thermodynamics of aqueous two-phase systems for bioseparations: AIChE Journal 34, 1585–1594 (1988).
7. Kress, C. & Brandenbusch, C. Osmotic virial coefficients as access to the protein partitioning in aqueous two-phase systems: Journal of Pharmaceutical Sciences 104, 3703–3709 (2015).
8. Peters, T. J. Partition of cell particles and macromolecules: Third Edition, John Wiley & Sons (1986).
9. Some, D., Hitchner, E. & Ferullo, J. Characterizing protein–protein interactions via static light scattering: Nonspecific interactions (2009).