A Fully Automated, Bottom-up Approach for MALDI-TOF MS Based Discovery Workflows

Význam tématu

Proteomické bottom-up přístupy s využitím MALDI-TOF MS představují klíčovou metodu pro detailní charakterizaci proteinů. Rychlá a reproducibilní příprava vzorku je nezbytná pro zvýšení počtu analyzovaných vzorků, minimalizaci variability a zkrácení doby analýzy v laboratořích základního výzkumu i průmyslové QA/QC.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout plně automatizovaný workflow kombinující online enzymatickou digesci, desalting, reverzní fázi a spotování na MALDI matici. Hlavním záměrem bylo zkrátit celkový čas experimentu z více než 18 hodin na méně než 30 minut a zároveň zlepšit sekvenční pokrytí modelového proteinu (BSA).

Použitá metodika a instrumentace

Postup byl založen na následujících krocích:

• Online digesce na imobilizovaném trypsinu (Perfinity Workstation, 4 min, 50 °C),
• Reverzní fáze na kolóně Phenomenex Aeris XB-C18 (15 min gradient 2–60 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí),
• Desalting mikrocolumnou ZipTip (Millipore) a frakční sběr na 384jádrové destičce,
• Spotování matice CHCA a eluátu pomocí AccuSpot (Shimadzu) ve splitovacím poměru 20:1 po 3s intervalech,
• MALDI-TOF/TOF analýza na přístroji Shimadzu AXIMA Performance s externí kalibrací,
• Vyhodnocení sekvenčního pokrytí MASCOT PMF (SwissProt) a manuální revize spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání plně automatizovaného protokolu s benchtop digesí ukázalo:

• Celkový čas analýzy: 28 minut vs. >18 hodin,
• Sekvenční pokrytí BSA: 87 % vs. 68 %,
• Redukovaná variabilita a vyšší reprodukovatelnost díky automatizaci,
• Možnost optimalizace parametrů digesce (teplota, doba), chromatografického gradientu a matice.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný PWS-AccuSpot workflow nabízí:

• Výrazné zkrácení doby přípravy vzorků,
• Zvýšení throughputu v proteomických laboratořích,
• Eliminaci uživatelských chyb a snížení rizika kontaminace,
• Vysoké sekvenční pokrytí vhodné pro identifikaci a charakterizaci proteinů v QA/QC i výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další výzkum se zaměří na:

• Studium vlivu doby a teploty digesce na sekvenční pokrytí,
• Zvyšování citlivosti snížením splitovacího poměru nebo splitless konfigurací,
• Rozšíření workflow na nízkomolekulární proteiny a komplexní biologické vzorky,
• Integraci kvantitativních metod a vícerozměrné chromatografie.

Závěr

Navržený plně automatizovaný bottom-up MALDI-TOF workflow spojující Perfinity Workstation a AccuSpot významně zefektivnil přípravu vzorků a zvýšil sekvenční pokrytí proteinu BSA. Tento systém nabízí robustní, vysoce reproducibilní a škálovatelný přístup pro proteomické aplikace v základním výzkumu i průmyslovém nasazení.