Online affinity and digestion: A flexible and robust tool for the characterization and quantification of proteins

Význam tématu

V klasickém proteomickém workflow vede manuální imunoprecipitace a proteolytická digesce k vysoké variabilitě výsledků a omezené kvantitativní reprodukovatelnosti. Plně automatizované online řešení spojující afinitní obohacení, enzymatickou digesci a chromatografickou separaci dokáže minimalizovat chyby obsluhy, zkrátit dobu přípravy vzorku a zvýšit citlivost i preciznost analýzy proteinových biomarkerů.

Cíle a přehled studie

Autoři prezentují modulární pracovní stanici schopnou:

• propojit kolony s imobilizovanými protilátkami a enzymatickým reaktorem
• provádět online afinitní zachycení a digesci bez manuálních intervencí
• přecházet plynule z datově závislého objevného režimu (DDA) na cílenou kvantitativní analýzu (MRM)

Study je demonstrována na hemoglobinu a imunoglobulinu G (IgG) pomocí LCMS-IT-TOF a LCMS-8050.

Použitá metodika a instrumentace

Pro online workflow autoři využili:

• Perfinity Workstation pro řízení afinitního sloupce (anti-Hb nebo Protein G) a imobilizovaného enzymatického reaktoru
• optimalizaci parametrů času, teploty a intenzity promývání
• Skyline pro návrh a výběr optimálních MRM přechodů
• Shimadzu LCMS-IT-TOF pro DDA analýzu sekvenčního pokrytí
• Shimadzu LCMS-8050 triple kvadrupól pro vysoce reprodukovatelnou MRM kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

Hemoglobin:

• Doba digesce 4 min při 40 °C přinesla téměř 100% pokrytí sekvence při 5% FDR
• Rozlišení a kvantifikace divokého a srpkovitého typu proběhla na 5minutovém gradientu s CV < 8 %

IgG:

• Cílená imuno-MRM analýza 12 peptidů z konstantní i variabilní oblasti
• Standardní křivky vykázaly lineární odezvu s vyššími R2 než 0,995

Přínosy a praktické využití metody

Online automatizace kombinuje obohacení, digesci a chromatografii v jednom kontinuálním protokolu, což vede k:

• časové úspoře (20–60 minut celkem)
• vysoké přesnosti (CV < 8 %)
• citlivé detekci nízkých koncentrací proteinů
• možnosti přímého přechodu od objevného ke kvantitativnímu režimu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj vidíme v:

• rozšíření multiplexních panelů proteinových biomarkerů
• miniaturních a high-throughput formátech
• integrované softwarové podpoře s automatickou analýzou a reportingem
• aplikacích v klinické proteomice a personalizované medicíně

Závěr

Perfinity Workstation představuje spolehlivé a plně automatizované řešení pro online afinitní zachycení i enzymatickou digesci vzorků před LC-MS/MS analýzou. Metoda nabízí vysokou reprodukovatelnost, špičkovou sekvenční pokrytí a citlivou kvantifikaci proteinových forem a je ideální pro implementaci proteinových biomarkerů v průmyslové i klinické praxi.

Reference

• Colquhoun D, Boutaghou MN, Lieberman R, Feild B, Meyer KW, Kuzdzal S. Online affinity and digestion: A flexible and robust tool for the characterization and quantification of proteins. White paper WP161, Shimadzu, 2014.