Workflow for Profiling Impurities in Synthetic Oligonucleotides Using the BioAccord™ LC- MS System with waters_connect™ Informatics

Význam tématu

Analýza nečistot v syntetických oligonukleotidech je klíčová pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti jako léčiv. S rostoucí délkou a komplexitou těchto molekul se zvyšují i nároky na citlivost a rozlišení analytických metod. Tradiční HPLC–MS metody s jednočtvrtkovými spektrometry jsou zdlouhavé, vyžadují manuální zásahy a nejsou optimální pro regulované prostředí.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout a validovat automatizovaný pracovní postup (Oligonucleotide Impurity Analysis Workflow) pro profilování nečistot syntetických oligonukleotidů na platformě BioAccord LC-MS s informatikou waters_connect. Workflow obsahuje metody a šablony zpráv pro cílenou i necílenou analýzu nečistot, minimalizuje manuální zásahy a zkracuje dobu analýzy z hodin na minuty.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byla použita UPLC soustava ACQUITY Premier s C18 kolonkou určenou pro oligonukleotidy a krátkým gradientem (solvent A: 5 mM TBuAA/1 µM EDTA, voda:ACN 90:10; solvent B: 5 mM TBuAA/1 µM EDTA, voda:ACN 20:80; průtok 0,25 mL/min; teplota kolony 50 °C). Detekce probíhala pomocí BioAccord (TOF) v negativním ESI módu, rozsah 400–5000 m/z, desolvatace při 400 °C (měkké podmínky) a 550 °C (tvrdé podmínky). Data zpracovává UNIFI App ve waters_connect.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace UPLC–TOF zvýšila rozlišení a snížila spotřebu rozpouštědel i odpad. TOF detektor umožnil odlišit near-izobarické nečistoty (např. n-U vs. n-C) při rozdílu méně než 1 Da, což by na jednočtvrtkovém MS nebylo možné. Automatizované workflow kombinuje cílenou (Targeted) a necílenou (Untargeted) analýzu:

• Targeted: kontrola systému, kalibrace FLP (Full Length Product), kvantifikace chromatograficky oddělených i koelutujících nečistot pomocí UV a extrahovaných iontových chromatogramů (XIC).
• Untargeted: ověření identity FLP (m/z a sodné addukty), zobrazení neznámých koelutujících nečistot nad prahovými hodnotami.

Při srovnání měkkých a tvrdých ionizačních podmínek workflow identifikovalo a odstranilo addukty, čímž se zlepšila přesnost kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby analýzy z hodin na desítky minut.
• Automatizace zpracování dat snižuje riziko lidské chyby a zvyšuje shodu s regulacemi.
• Jednoduchá adaptace na různé oligonukleotidy minimalizuje potřebu rozšířeného zaškolení.
• Snížení spotřeby nebezpečných rozpouštědel a produkce odpadu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k podpoře stále delších a chemicky modifikovaných oligonukleotidů, integraci pokročilých datových nástrojů pro strojové učení a plné kompatibilitě s cGxP prostředím. Zvýšené rozlišení a automatizace usnadní implementaci v průmyslových i výzkumných laboratořích.

Závěr

Představený Oligonucleotide Impurity Analysis Workflow na BioAccord LC-MS s waters_connect informatikou nabízí rychlou, automatizovanou a vysoce citlivou analýzu nečistot v syntetických oligonukleotidech. Metoda řeší slabiny tradičních přístupů a usnadňuje práci v regulovaném prostředí.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier UPLC System
• ACQUITY Premier Oligonucleotide C18 Column (130 Å, 1,7 µm, 2,1×50 mm)
• ACQUITY Premier TUV Detector (λ = 260 nm)
• BioAccord LC-MS System (TOF detektor) s negativní ESI
• waters_connect platforma s UNIFI App

Reference

1. Pourshashian S. Therapeutic Oligonucleotides, Impurities, Degradants, and Their Characterization by Mass Spectrometry. Mass Spectrom Rev. 2019;40(2):75–109.
2. Doneanu CE, Knowles C, Fox J, et al. Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier. Waters Application Note. 2021 Jul;720007301.
3. Rentel C, Gaus H, Bradley K, et al. Assay, Purity, and Impurity Profile of Phosphorothioate Oligonucleotide Therapeutics by Ion Pair-HPLC-MS. Nucleic Acid Therapeutics. 2022;32(3):206–220.