Improved dia-PASEF isolation window schemes for proteomics measurements

Význam tématu

Data-Independent Acquisition s využitím dia-PASEF představuje pokročilou techniku proteomických analýz, která díky kombinaci širokých izolačních oken a separace podle iontové mobility zvyšuje citlivost, reprodukovatelnost a hloubku proteomového pokrytí. Takto optimalizované metody jsou klíčové pro analýzu vzorků s nízkým množstvím materiálu, jako jsou digesty jednotlivých buněk, a podporují pokrok v biomedicínském výzkumu i průmyslové kvalitativní/kvantitativní analytice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a otestovat různé schéma izolačních oken dia-PASEF v m/z-mobilitním prostoru a optimalizovat je pro různé úrovně biologického vzorku (100 ng až 0,25 ng K562 digestu). Autoři porovnali konstantní i proměnné šířky oken, různé časy akumulace v TIMS a jejich vliv na pokrytí spektra a kvantifikaci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: Trypsinový digest lidské buněčné linie K562 v konečných koncentracích od 100 ng/μl do 0,25 ng/μl s přídavkem 0,015 % DDM.
Separace: nanoElute s 22minutovým gradientem (5–35 % ACN/0,1 % FA) při 250 nl/min, kolona Aurora Ultimate (25 cm × 75 μm) s CaptiveSpray ultra.
Spektrometrie: timsTOF Ultra ve spolupráci s dia-PASEF okny navrženými v py_diAID a manuálně dolaďovanými.
Zpracování dat: dia-NN 1.8.1 s knihovnou 560 000 prekurzorů, triplikáty bez cross-run normalizace, druhé kolo vyhledávání s funkcí Match Between Runs.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované schéma 3×8 oken s proměnnými šířkami zvýšilo selektivitu bez výrazné ztráty citlivosti. Při nižších koncentracích (0,25 ng) metoda identifikovala >47 000 prekurzorů a 5 400 proteingrup. Při 100 ng bylo dosaženo >105 000 prekurzorů a 8 500 proteingrup. Kratší TIMS rampy s více okny vedly k vyšší selektivitě, zatímco delší časy akumulace zlepšily detekci nízkoabundantních signálů. Klíčem k úspěchu bylo vyvážení cyklového času pod 2 s pro zachování vhodného rozlišení chromatografických špiček.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost umožňuje analýzu stopových množství proteinu.
• Reprodukovatelná kvantifikace díky pevnému schématu oken.
• Široké proteomové pokrytí bez náročné optimalizace metody.
• Vhodné pro biologické studie single-cell proteomiky i rutinní QA/QC v průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace návrhu oken pomocí strojového učení pro další zvýšení selektivity.
• Integrace se separačními technikami (kapilární elektroforéza, mikročipy) pro vyšší rozlišení.
• Aplikace na další typy vzorků, včetně posttranslačních modifikací.
• Rozvoj single-cell proteomiky s důrazem na integraci dat v reálném čase a adaptivní metody sběru dat.

Závěr

Optimalizované dia-PASEF schéma s využitím proměnných oken a řízené akumulace iontů v TIMS prokázalo vynikající citlivost a hloubku proteomického pokrytí i při minimálních množstvích vzorku, aniž by byla ohrožena rychlost sběru dat či reprodukovatelnost kvantifikace. Tato metoda nabízí univerzální přístup pro pokročilé proteomické aplikace.

Reference

• Skowronek M. et al. Mol. Cell. Proteomics, 21(9), 100279 (2022).