Unleashing the power of DIA acquisition on an Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer – precise and accurate quantitation at 260 SPD

Význam tématu

Proteomika založená na hromadné spektrometrii je klíčová pro pochopení biologických procesů a objev nových biomarkerů. Moderní přístroje umožňují zpracovávat stovky vzorků denně s vysokou kvalitou dat. Data-independent acquisition (DIA) poskytuje konzistentní kvantitativní informace bez chybějících hodnot, což je zásadní pro studie rozsáhlých biologických kohort.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo otestovat a optimalizovat vysokoprůchodný LC-MS workflow s gradienty umožňujícími 100 až 260 vzorků denně (SPD). Kombinace Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC, micropillar-array µPAC Neo kolony (5,5 cm) a Orbitrap Exploris 240 byla hodnocena z hlediska proteomické hloubky, kvantitativní přesnosti a dlouhodobé stability.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: komerční HeLa proteomický standard, tří-proteomový mix HeLa, E. coli a kvasinek v poměrech 1:1, 4:1 a 0,5:1.

• UHPLC: Vanquish Neo (Binary Pump N, Split Sampler NT, Column Compartment N)
• Kolona: µPAC Neo high-throughput (5,5 cm, 75 µm ID)
• Ionizace: Nanospray Flex zdroj se 30 µm emitorem
• MS: Orbitrap Exploris 240 (rezoluce MS1 30 000, MS2 15 000)
• DIA nastavení: izolační okna 8–16 m/z, HCD kolizní energie 28 %, skenovací rozmezí m/z 525–825
• Data processing: Spectronaut 18 (directDIA), DIA-NN 1.8.1, Proteome Discoverer 3.1 + CHIMERYS 2.0

Hlavní výsledky a diskuse

- Gradient 11 min (100 SPD) identifikoval ~5 000 proteinů a ~30 000 peptidů.
- Gradient 5,5 min (170 SPD): ~4 600 proteinů, ~22 000 peptidů.
- Gradient 3,5 min (260 SPD): ~4 000 proteinů, ~16 000 peptidů.
- Medián CV na úrovni proteinů < 5 %, peptidů < 10 % ve všech režimech.
- Kvantitativní poměry tří-proteomového mixu odpovídaly očekávaným (1:1, 4:1, 0,5:1) s úzkým rozptylem.
- Mezilaboratorní test (Belgium, Švýcarsko, Německo) potvrdil reprodukovatelnost s RSD 5–7 %.
- Robustnost: více než 1 000 po sobě jdoucích injekcí (100 SPD) bez úbytku identifikací (RSD ~1,4 %).

Přínosy a praktické využití metody

Workflow kombinuje vysokou produktivitu (až 260 SPD) s hlubokou proteomickou pokrývkou a nízkou variabilitou. Je ideální pro klinické a longitudinální studie, kde je třeba zpracovat stovky až tisíce vzorků s konstantním výkonem a spolehlivými kvantitativními výsledky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkracování analytických časů při zachování kvality dat, rozšíření DIA režimů s optimalizací oken a zdokonalené algoritmy pro analýzu dat bez nutnosti spektrálních knihoven. Integrace do plně automatizovaných platforem a aplikace strojového učení pro rychlejší biologické interpretace otevřou nové možnosti v personalizované medicíně.

Závěr

Popsaný workflow na bázi Orbitrap Exploris 240 a µPAC Neo kolony nabízí vynikající kompromis mezi rychlostí a hloubkou analýzy. Metoda je robustní, reprodukovatelná napříč laboratořemi a poskytuje vysokou kvantitativní přesnost, což ji činí vhodnou pro rozsáhlé proteomické studie.