High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow for accurate label-free quantitation

Význam tématu

Quantitativní proteomika bez značení (label-free) umožňuje přesné stanovení koncentrací tisíců proteinů v komplexních biologických vzorcích. Využití datově nezávislé akvizice (DIA) přináší vysokou reprodukovatelnost mezi běhy a minimalizuje problém chybějících hodnot. Optimalizace pracovního postupu pro vysokou propustnost a robustnost je klíčová zejména pro velké kohortní a klinické studie.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo ověřit kvalitativní a kvantitativní parametry LFQ pomocí optimalizované DIA metody na Orbitrap Exploris 240 a krátké 30 minutové gradientní separaci na micropillar array chromatografii. Studie zahrnuje analýzu dvou- a tříproteomických směsí modelujících biologické variace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky HeLa, E. coli a kvasinkového proteomického standardu byly smíchány v definovaných poměrech. Separace probíhala na Vanquish Neo UHPLC systému s μPAC Neo kolonou (50 cm) a EASY-Spray nano nosičem. Hmotnostní spektrometr Orbitrap Exploris 240 pracoval v režimu DIA s 30 minutovým gradientem a 12 m/z izolačními okny. Data se vyhodnocovala pomocí Spectronaut verzí 16 a 17 a alternativně pomocí open source DIA-NN.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza dvou-proteomové směsi potvrdila vysokou kvantitační přesnost a preciznost s mediány blízko teoretických poměrů a koeficienty variability pod 10 %. Ve tříproteomové mši byly přesně stanoveny poměry lidských, bakteriálních a kvasinkových proteinů s vynikající separací a linearitou dat. Robusnost celého pracovního postupu byla demonstrována stabilními počty identifikací přes 500 hodin akvizice bez významného úbytku. Přechod na directDIA+ ve Spectronaut 17 přinesl až 30 % více prekurzorů a 5 % více proteinových skupin oproti předchozí verzi a DIA-NN.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost díky 30 minutové separaci umožňuje analýzu stovek vzorků týdně
• Label-free DIA poskytuje konzistentní kvantitativní výsledky bez nutnosti časově náročné přípravy spektrální knihovny
• Robustní chromatografie a stabilní Orbitrap Exploris 240 podporují dlouhodobé monitoringové studie

Budoucí trendy a možnosti využití

Další posun lze očekávat v oblasti strojového učení pro predikci spektrálních knihoven, zkrácení analýzních časů a integraci metody do klinických a personalizovaných biomarkerových studií. Rozvoj open source softwaru a automatizace zpracování dat podpoří širší adopci DIA bez knihoven.

Závěr

Optimalizovaný HR-DIA pracovní postup na Orbitrap Exploris 240 spojený s micropillar array chromatografií splňuje nároky na přesnost, preciznost, robustnost a propustnost pro rozsáhlé kvantitativní proteomické studie bez značení. Library-free přístupy výrazně zjednodušují a zrychlují analýzy aniž by se snížila kvalita výsledků.

Reference

1. Stadlmann J, Hudecz O, Krššáková G et al Improved Sensitivity in Low-Input Proteomics Using Micropillar Array-Based Chromatography Anal Chem 91(22) 14203–14207 2019
2. Demichev V, Messner CB, Vernardis SI et al DIA-NN neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput Nat Methods 17 41–44 2020