High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow on an Orbitrap Ascend Tribrid mass spectrometer for accurate label-free quantitation

Význam tématu

Quantitativní proteomika je nezbytná pro pochopení globálních změn v proteinových expresích a mechanismů biologických procesů či onemocnění. Metoda bezznačkového kvantitativního měření (LFQ) s akvizicí nezávislou na datech (DIA) dokáže omezit problém chybějících hodnot a zlepšit přesnost v rozsáhlých souborech vzorků. Optimalizovaný workflow na Orbitrap Ascend Tribrid hmotnostním spektrometru umožňuje vyvážit citlivost, rychlost analýzy a rozlišovací schopnost pro aplikace od základního výzkumu po klinické studie.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a otestovat end-to-end workflow pro label-free kvantifikaci proteinů pomocí data-independent acquisition na Orbitrap Ascend Tribrid MS ve spojení s Vanquish Neo UHPLC a μPAC Neo HPLC kolonou. Testovány byly tři délky aktivního gradientu (60, 30 a 9 minut) na standardním HeLa peptidickém digestu a na modelu tří-proteomové směsi (lidské, kvasinkové a E. coli peptide). Studie zahrnovala porovnání výkonu s a bez FAIMS Pro, různé vzorkovací hmotnosti a benchmarkování tří softwarových řešení: Spectronaut 18, Proteome Discoverer s CHIMERYS a DIA-NN.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnovalo automatizovanou přípravu vzorků platformou AccelerOme, chromatografickou separaci na Vanquish Neo UHPLC s 50 cm μPAC Neo kolonu při průtoku 350 nL/min a tři rychlosti gradientu: 9, 30, 60 minut. Spektrální akvizice probíhá na Orbitrap Ascend Tribrid za použití FAIMS Pro pro snížení rušivých iontů. Data byla zpracována metodou library-free přímé analýzy (Spectronaut directDIA, DIA-NN) a inteligentním vyhledávacím algoritmem CHIMERYS v Proteome Discoverer.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid MS s FAIMS Pro
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC systém
• μPAC Neo HPLC kolona, 50 cm, 180 μm bed width
• Thermo Scientific EASY-Spray nano iontový zdroj
• AccelerOme automatizovaná platforma pro přípravu vzorků

Hlavní výsledky a diskuse

FAIMS Pro zvýšila počet identifikovaných proteinů o ~5 % při zachování vysoké citlivosti. Při 30min gradientu bylo identifikováno přes 7 000 proteinů s CV ~5 %. Pro 60min gradient se dosáhlo až 7 800 proteinů s CV ~4 %. Ultra-rychlý 9min gradient nabídl dvě varianty: Max ID (~5 400 proteinů) a Max Quan (CV ~6 %). Zvýšení vstupní hmotnosti na 500 ng HeLa vedlo k >8 100 proteinům na 60min metodě. Tří-proteomová směs potvrdila vynikající kvantitativní přesnost (mediány poměrů velmi blízké teoretickým hodnotám) a hluboké pokrytí (>11 000 proteinových skupin v 60min gradientu). Srovnání softwaru ukázalo, že Spectronaut, CHIMERYS a DIA-NN produkují 8 200–10 600 proteinů při 30min a 9 600–11 000 proteinů při 60min analýze. Použití library-based vyhledávání v DIA-NN přineslo dodatečný nárůst identifikací o 3–10 %, zejména u kratších gradientů.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný Velocity LFQ DIA workflow nabízí vysokou proteomickou hloubku, vynikající kvantitativní přesnost a adaptabilitu na různé throughputy. Metoda je vhodná pro velké kohortní studie, objev biomarkerů či průmyslové QA/QC procesy, kde je požadována kombinace robustnosti, reproducibility a rychlosti analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším směrem je rozšíření library-free přístupů s využitím strojového učení, zkracování gradientů pro vysokopropustné screeningy, aplikace ve studiu jednotlivých buněk a širší implementace v klinických laboratořích. Integrace pokročilých datových analytických nástrojů a další zvyšování citlivosti MS přístrojů umožní odhalit dosud nesledované biologické signály.

Závěr

Vyvinutý Velocity LFQ DIA workflow na Orbitrap Ascend Tribrid MS poskytuje vyváženou kombinaci hloubky proteomu, přesnosti kvantifikace a flexibility throughputu. Robustní nastavení se ukázalo jako vhodné pro různé typy vzorků a experimentálních designů, což podporuje jeho využití napříč akademickým i průmyslovým sektorem.

Reference

1. Stadlmann J., Hudecz O., Krššáková G. et al. Improved Sensitivity in Low-Input Proteomics Using Micropillar Array-Based Chromatography. Anal. Chem. 2019;91(22):14203–14207.
2. Thermo Scientific Technical Note TN1251: High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow for accurate label-free quantitation.
3. Demichev V., Messner C.B., Vernardis S.I. et al. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat. Methods 2020;1:41–44.