Metabolism study of the novel cathinone derivative 3-MMC combining three in vitro approaches, LC-HRMS acquisition and molecular networking tools

Význam tématu

Detekce metabolitů nových psychoaktivních látek (NPS) je nezbytná pro klinickou a forenzní toxikologii, zejména při screeningových vyšetřeních moči. Absence lidských in vivo dat podporuje využití spolehlivých in vitro modelů, které napodobují metabolické dráhy a umožňují včasnou identifikaci potenciálních biomarkerů expozice.

Cíle a přehled studie

Tato práce se zaměřila na charakterizaci metabolismu 3-metylmethcathinonu (3-MMC) pomocí tří in vitro modelů: lidské jaterní mikrosomy, hepatomové buňky HepaRG na miskách a 3D mikrofluidní HepaRG „organs-on-a-chip“. Cílem bylo porovnat schopnost každého modelu generovat a detekovat klíčové metabolity 3-MMC za použití vysoce rozlišené LC-HRMS a nástrojů molekulární sítě.

Použitá metodika a instrumentace

Studie využila následující experimentální postupy a přístroje:

• Inkubace 3-MMC (5 a 50 µM) s lidskými jaterními mikrosomy (2,5 mg/ml, NADPH, 60 min), buňkami HepaRG (48 h, 480 000 buněk/well) a HepaRG-on-chip (48 h, 500 000 buněk).
• UHPLC s kolonkou Shim-pack Velox Biphenyl (2,1×100 mm, 2,7 µm), mobilní fáze voda + 2 mM formiátu/amonná sůl + 0,002 % kyseliny mravenčí a methanol se stejnými aditivy, průtok 0,3 ml/min.
• QTOF LCMS-9030: MS sken m/z 70–1000, DDA-MS/MS sken m/z 40–1000, rozptyl energie 5–55 V, 20 dependentních skenů, cyklus <0,55 s.
• Software LabSolutions Insight Analyze a Assign pro detekci komponent a verifikaci fragmentace, dále MS-DIAL a GNPS pro molekulární networking a rozšířenou identifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Vznikla tři očekávaná metabolická deriváty 3-MMC:

• Hydroxy-3-MMC (m/z 194,1175 [M+H]+)
• Desmetyl-3-MMC (m/z 164,1070 [M+H]+)
• Dihydro-3-MMC (m/z 178,1226 [M+H]+)

Ve fibromozních mikrosomech i v miskových buňkách HepaRG byly detekovány všechny tři metabolity s rychlejší tvorbou v mikrosomech. V modelu organs-on-a-chip se prokázaly pouze desmetyl a dihydro deriváty, hydroxy metabolit chyběl, pravděpodobně kvůli objemu média a rozdílům dynamiky enzymatických reakcí.

Přínosy a praktické využití metody

• Zavedené in vitro modely umožňují rychlou a nákladově efektivní identifikaci NPS metabolitů bez nutnosti lidských studií.
• LC-HRMS v kombinaci s DDA-MS/MS a molekulárním networkingem zvyšuje spolehlivost a šíři metabolitového profilu.
• Výsledky se dají přímo využít pro rozšíření screeningových databází a metod QC/QA v toxikologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace 3D mikrofluidních modelů s dalšími typy buněčných kultur pro komplexnější simulaci lidského metabolismu.
• Rozšíření molekulárního networkingu o strojové učení pro predikci dosud neznámých biotransformací.
• Standardizace in vitro protokolů a jejich validace vůči klinickým vzorkům.

Závěr

Porovnání tří in vitro modelů pro 3-MMC ukázalo, že lidské mikrosomy poskytují nejrychlejší výsledky, HepaRG buňky generují bohatý metabolitový profil a organs-on-a-chip nabízejí nejvyšší míru fyziologické relevance. Kombinace LC-HRMS, DDA-MS/MS a molekulárního networkingu představuje efektivní workflow pro identifikaci NPS metabolitů v toxikologickém kontextu.

Reference

• Zarrouk E., Barnes A., Moreau S., Loftus N., Dulaurent S., Elbalkhi S., Saint-Marcoux F. Metabolism study of the novel cathinone derivative 3-MMC combining three in vitro approaches, LC-HRMS acquisition and molecular networking tools. CHU Limoges; Shimadzu Corporation; Shimadzu Europa GmbH.