Guide to Size-Exclusion Chromatography (SEC) of mAb Aggregates, Monomers, and Fragments

Význam tématu

Size-exclusion chromatography (SEC) je klíčová technika pro analýzu monoklonálních protilátek, jejich agregátů a fragmentů. Umožňuje separaci biomolekul podle hydrodynamického objemu bez sekundárních interakcí, což zajišťuje přesnost, reprodukovatelnost a spolehlivost výsledků v oblasti výzkumu, vývoje i kontroly kvality bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem dokumentu je představit zásady výběru a optimalizace LC-based BEH SEC metodiky pro kvantitativní a kvalitativní stanovení mAb monomerů, agregátů >300 kDa a fragmentů <100 kDa. Popisuje výběr vhodných sloupců, vliv parametrů mobilní fáze, propojení kolony a LC systému, minimalizaci systémové disperze a postupy pro prodloužení životnosti kolony.

Použitá metodika

• Výběr sloupce podle rozsahu molekulové hmotnosti (125 Å pro 1–80 kDa, 200 Å pro 10–450 kDa, 450 Å pro 100–1500 kDa)
• Optimalizace částicové velikosti (1,7 µm pro UPLC, 2,5–3,5 µm pro UHPLC/HPLC)
• Nastavení mobilní fáze: 20–350 mM fosfátové pufry, pH 6,0–7,5 se 150–350 mM NaCl pro redukci sekundárních interakcí
• Stanovení a omezení LC systémové disperze na <15 µl (4σ) pro ostré píky a maximální rozlišení
• Preventivní filtrace vzorků (0,2 µm) a mobilních fází (sterilní 0,2 µm membránové filtry)
• Použití krátkých guard kolonek před hlavním kolenem pro ochranu před kontaminací

Použitá instrumentace

• Chromatografický systém ACQUITY UPLC H-Class Bio s Tunable UV detektorem (280 nm)
• ACQUITY UPLC sloupce Protein BEH SEC 125 Å, 200 Å a 450 Å (1,7; 2,5 µm) o dimenzích 4,6×150/300 mm
• Zkušební směsi standardů BEH125, BEH200 a BEH450 SEC Protein Standard Mix pro kalibraci

Hlavní výsledky a diskuse

• BEH materiál s diolovým povrchem výrazně snižuje silanolové interakce a umožňuje použití částic do 1,7 µm pro zvýšenou účinnost a zkrácení analýzy
• Správné připojení kolony k systému minimalizuje netěsnosti i mrtvý objem
• Systematické měření disperze LC systému pomocí kalibrace s kafem a vodou pomáhá udržet optimální rozlišení
• Laboratorní postupy pro čištění a dezinfekci (70 % IPA, 10 % kyseliny fosforečné, methanol) brání mikrobiální kontaminaci a prodlužují životnost kolony až na 1000 a více injekcí

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vyšší rozlišení a rychlost separace oproti tradičním HPLC-SEC, spolehlivou kvantifikaci agregátů a fragmentů mAb, reprodukovatelné výsledky pro QA/QC procesy a flexibilitu volby kolony dle analytických potřeb.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturální analýzu
• Automatizace přípravy vzorků a on-line čištění systémů
• Vývoj nových hybridních materiálů pro rozšíření rozsahu analytických aplikací
• Využití strojového učení pro predikci optimálních podmínek separace

Závěr

Robustní BEH SEC metoda na UPLC principech umožňuje rychlou a přesnou analýzu mAb monomerů, agregátů a fragmentů. Klíčem k dlouhodobé stabilitě je správný výběr sloupce, controla systémové disperze, důsledná filtrace vzorků a systematické čištění LC systému.

Reference

1. Hong P., Koza S.M., Bouvier E.S.P. Size-exclusion chromatography for analysis of protein biotherapeutics and their aggregates. J. Liq. Chrom. Rel. Tech. 2012, 35(20), 2923-2950.
2. Bouvier E.S.P., Koza S.M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Analyt. Chem. 2014, 63, 85-94.
3. Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities. US CDC 2008.
4. Koza S.M., Reed C.E., Chen W. Impact of LC system dispersion on SEC analysis of proteins. Waters App. Note 720006337EN, 2019.
5. Koza S.M., Reed C., Chen W. Impact of LC system dispersion on SEC analysis of mAb aggregates and fragments. Waters App. Note 720006336EN, 2019.
6. Hong P., Fountain K. Method development for SEC of monoclonal antibodies and aggregates. Waters App. Note 720004076EN, 2011.