SMART Digest compared to classic in-solution digestion of rituximab for in-depth peptide mapping characterization

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je základní analytickou metodou v biotechnologickém průmyslu při ověřování identity, čistoty a stability léčivých bílkovin. Tradiční in-solution digesce bývá časově náročná a může během přípravy vzorku indukovat umělé modifikace (deamidace, oxidace, karbamylace). Rychlé a reprodukovatelné enzymatické štěpení za zvýšené teploty nabízí potenciál zkrátit dobu analýzy a minimalizovat nežádoucí artefakty.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat klasické in-solution digesční protokoly (denaturace v ureu či zahřátím + DTT/IAA) s novou Thermo Scientific SMART Digest kit metodou při štěpení monoklonální protilátky rituximab. Hodnotilo se dosažené sekvenční pokrytí lehkého a těžkého řetězce, identifikace a relativní kvantifikace hlavních post-translačních modifikací (glykozylace, deamidace, oxidace, karbamylace) a reprodukovatelnost výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorcem byl komerční rituximab (10 mg/mL). Klasické postupy využily denaturaci v 7 M ureu (pH 8) nebo při 70 °C, redukci 5 mM DTT, alkylaci 15 mM IAA a noční digesci trypsinem (40:1). SMART Digest kit používal imobilizovaný trypsin při 70 °C po dobu 15–75 min. Následovalo zředění 0,1 % kyselinou mravenčí a LC–MS analýza.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary (C18 Acclaim VANQUISH, 2.1 × 250 mm, 2.2 µm, T=50 °C, 0.3 mL/min)
• MS: Thermo Scientific Q Exactive HF Orbitrap (HESI-II, Full MS 60 000 FWHM, MS/MS 15 000 FWHM, top 5 DDA)
• Software: Chromeleon 7.2 SR4 pro akvizici, BioPharma Finder 1.0 SP1 pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

• 100% sekvenční pokrytí lehkého i těžkého řetězce rituximabu bylo dosaženo u všech šesti testovaných protokolů, již za 15 min u SMART Digest.
• Reprodukovatelnost retenčních časů a kvantitativních výsledků byla u SMART Digest vynikající (RSD < 5 %).
• Celkový počet detekovaných peptide a jejich iontových signálů byl u SMART Digest vyšší než u in-solution metod.
• Relativní množství deamidace a oxidace bylo srovnatelné, nejnižší deamidace vykázal SMART Digest po 15 min (deamidation factor = 1,0, oproti 8,8 u in-solution zahřátím).
• Karbamylace lysinů byla prakticky nulová u SMART Digest díky absenci urey.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá digesce (15–60 min) s minimem nežádoucích modifikací umožňuje pravidelné a standardizované peptide mapping workflow. Metoda zkracuje přípravu vzorku, zvyšuje propustnost laboratoře a omezuje artefakty spojené s pH a teplotou.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace štěpení v rámci plně integrovaných LC–MS platform
• Využití pro rozsáhlé screeningové studie stability bioterapeutik
• Aplikace na další typy proteinů a biologických makromolekul
• Vývoj nových imobilizovaných enzymů pro selektivní digesci
• On-line post-digesce a on-line desalting v rámci jednoho zařízení

Závěr

SMART Digest kit představuje efektivní alternativu ke klasické in-solution tryptické digesci monoklonálních protilátek. Zkrácení doby digesce, vynikající reprodukovatelnost a nižší míra indukovaných modifikací potvrzují jeho vhodnost pro rutinní peptide mapping v biopharmaceutické kontrole kvality.

Reference

• Ren D. et al. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications on proteins. Analytical Biochemistry, 2009, 392, 12–21.
• Thermo Scientific SMART Digest Kit Technical Guide, Runcorn, UK, 2015.
• Thermo Scientific Application Note 21198: Improvement in Speed and Reproducibility of Protein Digestion and Peptide Quantitation. Runcorn, UK, 2015.
• Nebija D. et al. Comparison of two-dimensional gel electrophoresis patterns and MALDI-TOF MS analysis of therapeutic recombinant monoclonal antibodies trastuzumab and rituximab. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, 56, 684–691.
• Kollipara L., Zahedi R.P. Protein carbamylation: in vivo modification or in vitro artefact? Proteomics, 2013, 13, 941–944.
• Dick L.W. et al. Peptide mapping of therapeutic monoclonal antibodies: Improvements for increased speed and fewer artifacts. Journal of Chromatography B, 2009, 877, 230–236.
• Visser J. et al. Physicochemical and Functional Comparability Between the Proposed Biosimilar Rituximab GP2013 and Originator Rituximab. BioDrugs, 2013, 27, 495–507.