Rapid Screening of Bispecific Antibodies and Antibody Impurities using In-source Collision Induced Unfolding coupled with IM-MS

Význam tématu

Bispecifické protilátky představují klíčový směr v moderní biologické terapii, vyžadují však citlivé a rychlé metody pro detekci strukturálních variant a impurit. Kombinace iontové mobility s kolizně indukovaným unfoldingem (CIU) přináší detailní konformační informace a umožňuje efektivní rozlišení monomerů, dimerů i trimerů.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl otestovat výkonnost Agilent 6560C IM-QTOF s in-source CIU pro screening bispecifických protilátek (bsAb1 až bsAb4) a jejich variant se zásahy do disulfidických vazeb. Pro srovnání byly využity standardní monoklonální protilátky Herceptin a NIST mAb a enzymaticky připravené fragmenty F(ab’)2.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrument: Agilent 6560C IM-QTOF vybavený in-source aktivací
• Zdroj: AJS s micro-nebulizérem, aplikace vzorku pomocí injekční pumpy
• Úprava vzorků: výměna pufru na 200 mM octan amonný, odsolení sloupcem Bio-Spin P-6, koncentrace 4–10 µM
• CIU protokol: in-source CE napětí 0–430 V ve 10 V krocích, 12 s na krok
• Software: CIUSuite2 pro analýzu CIU fingerprintů a statistickou klasifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

• CIU fingerprinty nábojových stavů +25, +26, +27 ukázaly odlišné CCS přechody a specifické CIU50 hodnoty pro jednotlivé bsAb vzorky.
• Průměrné vnitro-vzorkové RMSD ~2,7–4,5 %, vzájemné porovnání ~10,1–12,6 %, což dokládá významné strukturální rozdíly.
• Nižší RMSD 6,8 % mezi bsAb2.2 a bsAb3.2 naznačuje vyšší podobnost jejich konformací.
• Lineární diskriminační analýza umožnila přesnou klasifikaci všech testovaných vzorků, včetně ověření známé bsAb4.2 jako testovacího příkladu.
• Vysoké in-source CE podmínky vedly k disociaci nekovalentních dimerů na monomery, což poskytuje informace o síle a povaze interakcí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda výrazně zkracuje dobu analýzy oproti tradiční SEC, zvyšuje rozlišení strukturálních forem a podporuje automatizované rutinní kontroly kvality v biotechnologickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace CIU-IM-MS do standardních QA/QC procesů, rozšíření na další velké biomolekuly, spojení s bioinformatickými nástroji a strojovým učením pro hlubší interpretaci konformačních dat.

Závěr

CIU ve spojení s iontovou mobilitou na přístroji Agilent 6560C IM-QTOF se osvědčilo jako spolehlivý a citlivý nástroj pro rychlý screening bispecifických protilátek a detekci jejich strukturových impurit.

Reference

• Boucher L E et al MABS 2023 15(1) 2195517
• Gadkari V V et al Analyst 2023 148(2) 391-401
• Kurulugama R T et al ASMS 2022 TP298