A native multi-dimensional monitoring workflow for at-line characterization of mAb titer, size, charge, and glycoform heterogeneities in cell culture supernatant

Význam tématu

Růst poptávky po rychlém a komplexním charakterizování biologických léků klade důraz na metody Process Analytical Technology (PAT). Native více-dimenzionální multi-attribute monitoring (n-MD-MAM) nabízí možnost sledovat titr, velikostní a nábojové varianty a rozložení glykoform přímo v buněčném supernatantu. Tím lze výrazně zrychlit rozhodovací procesy a minimalizovat předúpravy vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat nativní workflow sestávající z ProA ve spojení se SEC v první dimenzi a WCX s hyphenací na hmotnostní spektrometrii ve druhé dimenzi. Metoda byla testována na supernatantu CHO buněk exprimujících trastuzumab a porovnána s očištěným přípravkem (drug product).

Použitá metodika a instrumentace

Workflow je rozděleno do dvou dimenzí:

• 1D ProA-SEC: třífázový proces selektivní vazby, eluce a velikostní separace na kolónách Bio-Monolith rProteinA a BioCore SEC-300.
• 2D WCX-MS: separace nábojových variant na kolóně BiomAb NP5 PK za použití volitelných ammonium acetátových pufrů kompatibilních s MS.

Použitá instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II LC
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
• Agilent MassHunter BioConfirm software

Hlavní výsledky a diskuse

• Účinný přenos eluce z ProA do SEC umožnil kvantifikaci titru s LOD 0,5 µg a LOQ 1,5 µg pro první dimenzi a 6,5 µg/19,7 µg pro druhou dimenzi.
• 2D WCX rozlišilo osm nábojových variant, které byly pomocí MS dekonvoluovány k určení rozložení glykoform (G0, G0F, G1F a další) a modifikací (deamidace, oxidace).
• Komparace supernatantu (DS) a purifikovaného produktu (DP) odhalila rozdíly ve složení nábojových variant i glykoform, což demonstruje citlivost a selektivitu metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda eliminuje samostatné purifikační kroky a umožňuje monitoring kritických atributů přímo ve výrobním procesu. To přispívá ke zkrácení doby analýzy, vyšší efektivitě kontroly kvality a rychlejší zpětné vazbě pro rozhodování.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími kroky jsou automatizace heart-cut strategií, integrace s řídicími systémy výroby a rozšíření aplikace pro další třídy biologik. Zvyšování rozlišení glykoform a identifikace vzácných modifikací pomocí pokročilých MS technik podpoří hlubší porozumění produktové heterogenitě.

Závěr

Navržené n-MD-MAM workflow kombinuje nativní chromatografické separace a hmotnostní spektrometrii v jediném postupu, což umožňuje komplexní charakterizaci monoclonálních protilátek přímo z buněčného supernatantu. Metoda je citlivá, robustní a připravená k nasazení jako součást online/offline PAT strategií.

Reference

1. Bhattacharya S, Joshi S, Rathore AS. Native multi-dimensional monitoring workflow for at-line characterization of mAb titer, size, charge, and glycoform heterogeneities in cell culture supernatant. Journal of Chromatography A. 2023;1696:463983.
2. Jakes C, Füssl F, Zaborowska I, Bones J. Rapid analysis of biotherapeutics using Protein A chromatography coupled to Orbitrap mass spectrometry. Analytical Chemistry. 2021;93(40):13505-12.