Multi-Attribute Analysis of Monoclonal Antibodies Using the Agilent InfinityLab 2D-LC Solution and Q-TOF MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčové léčivé molekuly v onkologii, imunologii a dalších oborech. Jejich biologická účinnost a bezpečnost závisí na řadě kritických parametrů, jako je titer, agregace, fragmentace, post-translační modifikace či glykozylace. Jednotlivé atributy obvykle vyžadují odstupňované analytické přístupy a složitou kombinaci technik. Integrace více metod do jednoho automatizovaného pracovního postupu výrazně zvyšuje efektivitu a spolehlivost kontroly kvality v bioprodukci.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat plně online třírozměrný (3D) systém pro multi-atributovou analýzu mAbs přímo z buněčných supernatantů. Konfigurace kombinuje:

• protein A afinitní chromatografii pro kvantifikaci titru,
• velikostní vylučovací chromatografii (SEC) pro oddělení velikostních variant,
• reverzní fázi (RPLC) pro odsolení,
• Q-TOF hmotnostní spektrometrii pro určení molární hmotnosti, sekvence a modifikací.

Implementováno bylo řešení Agilent 1290 Infinity II 2D-LC s více heart-cutting ventily a Agilent 6530 Q-TOF LC/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický postup probíhal ve třech dimenzích: protein A → SEC → RPLC/desalting → MS.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC System (multisampler, MCT, DAD, ventily a pumpy pro online multi-heart-cutting)
• Agilent 1260 Infinity II Quaternary Pump
• Agilent 6530 Q-TOF LC/MS s Agilent Jet Stream ESI
• Protein A kolona Bio-Monolith (Agilent)
• AdvanceBio SEC kolona 300 Å, 7.8×300 mm
• Reverzní fázový desaltingový cartridge 2.1×10 mm
• Software: Agilent OpenLab CDS a MassHunter s BioConfirm add-on

Hlavní výsledky a diskuse

Systém umožňuje v jediné metodě:

• rychlé a přesné měření titru mAb pomocí UV detekce (RSD RT <0,15 %, lineární rozsah 10–100 µg),
• rozdělení a kvantifikaci agregátů (HMW) a fragmentů (LMW) s přesností lepší než 1 %; SEC peak purity 95,6 %;
• dekonvoluci MS dat pro stanovení molární hmotnosti ± 0,1 Da a identifikaci glykoform a bodových mutací;
• automatizované přepínání ventily pro více heart-cutting odebírání frakcí z SEC.

Metoda byla validována opakovatelností retence a ploch (RSD <1 %) a aplikována na výběr klonu pro biosimilární vývoj tocilizumabu. Analýza odhalila clone-dependentné rozdíly v glykoformách a bodových mutacích, na základě kterých byl vyřazen nevhodný klon.

Přínosy a praktické využití metody

SAMOPOUŽITÍ multi-atributového analyzátoru přináší:

• úsporu času a materiálu díky plné online automatizaci bez potřeby manuální přípravy frakcí,
• zvýšení reproductibility a kvality dat,
• možnost rychlého screeningu klonů v raných fázích vývoje,
• integrovanou kontrolu kritických quality attributes v jedné běžné LC-MS metodě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření dimenzionality chromatografie (systémy 4D-LC) a využití vysokorozlišovacího MS s ion mobility pro detailnější charakterizaci vzácných PTM. Trendem je také použití umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci multi-atributových dat z bioprodukce.

Závěr

Prezentovaný 3D-LC-MS postup kombinuje protein A afinitu, SEC a RPLC s Q-TOF MS do jednoho robustního workflow pro komplexní analýzu mAbs. Metoda prokázala vysokou přesnost, reproducibilitu a praktičnost v biotechnologickém vývoji, zejména při výběru klonů a kontrole kvality.

Reference

1. Sandra K.; Vandenheede I.; Sandra P. Modern Chromatographic and Mass Spectrometric Techniques for Protein Biopharmaceutical Characterization. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. Fekete S. et al. Chromatographic, Electrophoretic and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.
3. Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 1136–1145.
4. Sandra K. et al. The Versatility of Heart-Cutting and Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography in Monoclonal Antibody Clone Selection. J. Chromatogr. A 2017, 1523, 283–292.
5. Stoll D. et al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products by Two-Dimensional Liquid Chromatography Coupled with UV Absorbance and Mass Spectrometric Detection. J. Chromatogr. B 2016, 1032, 51–60.