Rapid analysis of titer, aggregate and intact mass of antibody therapeutics using multi-dimensional liquid chromatography coupled with native mass spectroscopy

Význam tématu

Multiparametrové sledování bioterapeutik kombinuje chromatografii a hmotnostní spektrometrii v online režimu, což umožňuje současné stanovení titru, agregátů a intaktního hmotnostního spektra monoklonálních protilátek během několika minut. Metoda významně zkracuje dobu analýzy, minimalizuje manuální zásahy a zvyšuje reprodukovatelnost, což je klíčové pro kontrolu kvality a procesní analytické technologie v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce je představit rychlý online workflow 2D-LC/MS využívající afinitní chromatografii na protein-A pro stanovení titru v první dimenzi a SEC-MS pro analýzu velikostních variant ve druhé dimenzi. Studie demonstruje aplikaci na dvě referenční monoklonální protilátky (mAb A a mAb B) a na vzorek kultivačního média.

Použitá metodika a instrumentace

Studie využívá heart-cut 2D-LC spojené s nativní hmotnostní spektrometrií:

• První dimenze: Bio-Monolith rProtein A kolona (4,95×5,2 mm) na UHPLC Agilent 1290 Infinity II pro purifikaci a stanovení titru.
• Druhá dimenze: AdvanceBio SEC kolona (300 Å, 4,6×150 mm, 2,7 µm) na stejném UHPLC pro rozlišení velikostních variant.
• MS detekce: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Agilent JetStream ESI, nastavení suchý plyn 350 °C/13 L/min, tlak rozprašovače 35 psi, teplota pláště 300 °C, tryska 5500 V, fragmentor 150 V, m/z rozsah 2500–20000, rychlost 1 spektrum/s.
• Software: MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition 10.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza monoklonální protilátky mAb A:

• Purifikace a stanovení titru v D1, přenos hlavního vrcholu do D2 metodou heart-cut.
• SEC-MS profil ukázal monomerní formu s m/z 5000–7000 a nabitím +22 až +28.
• Dekonvoluce identifikovala tři hlavní glykofomy: G0F/G0F (~148 058 Da), G0F/G1F (~148 219 Da) a G1F/G1F (~148 380 Da).

Case Study I – monoklonální protilátka mAb B:

• D1 poskytla jediný vrchol, v D2 se rozlišilo ~22 % HMWs a ~78 % monomer.
• HMWs dekonvoluce: ~298 402 Da, ~298 723 Da, ~299 048 Da a ~299 372 Da odpovídající různým glykofomám.
• Monomerní dekonvoluce: ~149 201 Da, ~149 363 Da, ~149 524 Da a ~149 685 Da pro čtyři glykovarianty.

Case Study II – analyza kultivačního média (mAb A):

• Purifikace ze supernatantu potvrdila jasnou separaci monomeru od neafinitních složek.
• SEC-MS ukázalo ~0,9 % HMWs a ~99 % monomer se stejnými glykofomovými profily jako u čistého vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí velmi rychlou analýzu (<8 min), nízkou spotřebu vzorku (10–15 µg) a eliminuje časově náročné manuální kroky včetně buffer exchange. Je vhodná pro rutinní kontrolu kvality (QC) a on-line procesní monitoring (PAT) ve výrobě bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření do více chromatografických dimenzí, integrace pokročilých algoritmů a umělé inteligence pro automatizovanou analýzu dat a optimalizaci procesů v reálném čase.

Závěr

Předložená 2D-ProA-SEC-MS metoda umožňuje komplexní a rychlou charakterizaci monoklonálních protilátek se stanovením titru, agregátů a detailní analýzou glykoforem bez nutnosti manuálních zásahů či dlouhých přípravných kroků.

Reference

1. Stoll D.R., Carr P.W. Two-Dimensional Liquid Chromatography: A State of the Art Tutorial. Anal. Chem. 2017, 89, 519–531.
2. Ehkirch A. et al. A Novel Online Four-Dimensional SEC×SEC-IM×MS Methodology for Characterization of Monoclonal Antibody Size Variants. Anal. Chem. 2018, 90, 13929–13937.
3. Verscheure L. et al. 3D-LC-MS with 2D Multimethod Option for Fully Automated Assessment of Multiple Attributes of Monoclonal Antibodies. Anal. Chem. 2022, 94, 6502–6511.
4. Sarin D., Kumar S., Rathore A.S. Multiattribute Monitoring of Charge-Based Heterogeneity of Recombinant Monoclonal Antibodies Using 2D HIC-WCX-MS. Anal. Chem. 2022, 94(43):15018–15026.