Determination of Oversulfated Chondroitin Sulfate and Dermatan Sulfate in Heparin Sodium Using Anion-Exchange Chromatography with UV Detection

Význam tématu

Heparin je klíčové antikoagulační činidlo široce používané v chirurgii a dialýze. Závažné nežádoucí účinky a vysoká mortalita hlášená v roce 2008 byly spojeny s přítomností vysoce sulfátované nečistoty – oversulfated chondroitin sulfate (OSCS). Nutnost spolehlivé detekce OSCS a dermatan sulfátu jako potenciálních kontaminantů vedla k revizi monografie USP Heparin Sodium a zavedení výkonné aniontové chromatografie s UV detekcí pro zajištění bezpečnosti a kvality heparinových produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikační poznámky je popsat separaci a kvantifikaci dermatan sulfátu a OSCS v heparinu sodném pomocí aniontové výměnné chromatografie (AE) s UV detekcí, jak vyžaduje úprava USP Stage 2. Metoda využívá gradientní eluci na kolóně IonPac AS11 (2 mm) při 0,22 mL/min a vlnové délce detekce 202 nm. Studie hodnotí liniaritu, citlivost, přesnost, opakovatelnost a dlouhodobou stabilitu metody.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická metodika zahrnuje:

• Aniontová výměnná chromatografie na kolóně IonPac AG11 (guard) + AS11 analytické (2×250 mm, 2 mm ID)
• Dionex ICS-3000 systém: SP nebo DP pumpa, GM-4 gradientní mixer, TC tepelný komorový modul, VWD 3400 UV detektor s PEEK semi-mikro článkem (2,5 µL), AS autosampler s injekční stříkačkou 100 µL
• Mobilní fáze A: 2,6 mM NaH₂PO₄ (pH 3,0); B: 1,0 M NaClO₄ v 2,6 mM NaH₂PO₄ (pH 3,0); gradient 20→90 % B (0–60 min), 90→20 % B (60–61 min)
• Teplota kolony 30 °C (USP doporučuje 40 °C po publikaci revize), teplota autosampleru 10 °C, objem injekce 10 µL
• Detekce UV při 202 nm

Hlavní výsledky a diskuse

1% (v/v) standartní směs (0,2 mg/mL dermatan sulfátu, 0,2 mg/mL OSCS, 20 mg/mL heparinu) poskytla příměry menší než 1 %. Retenční časy byly 16,8 ± 0,6 min pro dermatan sulfát, 25,1 ± 0,3 min pro heparin a 41,7 ± 0,2 min pro OSCS. Rozlišení (USP) dermatan sulfátu od heparinu dosahovalo 1,1 ± 0,1 (požadavek NLT 1,0), a heparinu od OSCS 1,8 ± 0,1 (NLT 1,5). Metoda byla stabilní po 310 injekcích za 27 dní, s průměrným rozlišením 1,04 ± 0,07 pro dermatan sulfát a 1,76 ± 0,12 pro OSCS. Variace pH mobilních fází (2,9–3,1) neměla významný vliv na retenci ani rozlišení. Kolony vykázaly dobrou reprodukovatelnost mezi stejnými šaržemi.

Přínosy a praktické využití metody

• Citlivá detekce <1 % příměsí OSCS a dermatan sulfátu
• Vysoká selektivita a odolnost vůči matrice díky AE kolóně s nízkou kapacitou
• Nízká spotřeba mobilní fáze a minimální odpad díky průtoku 0,22 mL/min
• Vhodné pro rutinní kontrolu kvality farmaceutických surovin i finálních produktů
• Metoda splňuje požadavky USP na přesnost, opakovatelnost a robustnost

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace parametrů (teplota 40 °C, jemnější gradienty) pro lepší rozlišení dermatan sulfátu
• Rozšíření na detekci dalších glykozaminoglykanů (chondroitin sulfát A, C) v komplexních matricích
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturální analýzu příměsí
• Miniaturizace a automatizace metodiky pro vysokokapacitní screening
• Vývoj zelených protokolů s recyklací elučních pufrů a ekologicky šetrných solí

Závěr

Popisovaná AE-UV metoda podle USP Stage 2 revize umožňuje spolehlivou separaci a kvantifikaci dermatan sulfátu a OSCS v heparin sodném při nízké spotřebě mobilní fáze a vysoké stabilitě systému. Metoda splňuje požadavky na rozlišení, přesnost a robustnost a je vhodná pro rutinní QA/QC kontrolu heparinových výrobků.

Reference

1. Goldstein J. Making Heparin is a Dirty Job. WSJ, 2008.
2. Tyrrell D., Horne A.P., Holme K.R., Preuss J.M.H., Page C.P. Heparin in Inflammation. Adv. Pharmacol. 1999;46:151–162.
3. Rutty C.J. Miracle Blood Lubricant: Connaught and the Story of Heparin. Employee News, 1996;9(4):1928–1937.
4. FDA Press Release: Baxter’s Heparin Adverse Reactions. Feb 2008.
5. Guerrini M. et al. Oversulfated Chondroitin Sulfate is a Contaminant in Heparin. Nat. Biotechnol. 2008;26:669–675.
6. Heparin Sodium monograph. USP 31-NF 26 Suppl. 2, 2008.
7. Heparin Sodium monograph. USP 32-NF 25 Suppl. 2, 2009.
8. Heparin Sodium, Pharmacopeial Forum 2009;35(2):1–10.
9. Dionex Corp. Determination of Organic Impurities in Heparin by HPAE-PAD, App. Note 233; LPN 2286, 2009.
10. Dionex Corp. Product Manual IonPac AG11/AS11; Doc. 034791, 2006.
11. Dionex Corp. ICS Series VWD Manual; Doc. 065141, 2006.
12. Heparin Sodium, Pharmacopeial Forum 2009;35(5):1–4.