Determination of Galactosamine Containing Organic Impurities in Heparin by HPAE-PAD Using the CarboPac PA20 Column

Význam tématu

Heparin je klíčové antikoagulační činidlo, jehož kontaminace oversulfovaným chondroitin sulfátem vedla v roce 2008 k závažným nežádoucím reakcím a stažení sérií z trhu. Proto je spolehlivá analýza organických nečistot nezbytná pro zajištění bezpečnosti pacientů.

Cíle a přehled studie

Cílem Application Note bylo implementovat a ověřit navrhovanou USP metodu pro stanovení galaktosaminy uvolněné kyselou hydrolýzou heparinu. Studie porovnávala výkonnost generátoru eluentu (EG) a ručně připravených hydroxidových elučních pufrů, testovala vliv různých sloupcových sestav a hodnotila robustnost metody.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky heparinu byly hydrolyzovány 5 N HCl při 100 °C po dobu 6 h, po ochlazení a naředění DI vodou následovala chromatografie HPAE-PAD. Detekce probíhala pulzní amperometrií na jednorázové zlaté elektrodě.
Instrumentace:

• Dionex ICS-3000 RFIC-EG: SP/DP pumpa, EG eluent generator, DC detektor, autosampler
• Eluent cartridge EluGen EGC II KOH a CR-ATC aniontový filtr
• AminoTrap 3×30 mm a CarboPac PA20 3×150 mm analytický a odpovídající guard sloupec
• Chromeleon 6.8 pro řízení systému a vyhodnocování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje rozlišení galaktosaminy a glukosaminy >3 (USP požadavek ≥2), účinnosti >4000 pater a asymetrie špiček 1,1–1,4. Detekce 0,04 % GalN ve výchozím heparinu a přesné stanovení 1,3 % při příměsi dermatan sulfátu potvrzuje citlivost a linearitu metody. Generátor elučních pufrů i manuální KOH/NaOH poskytují ekvivalentní výsledky. Odstranění AminoTrap sloupce neovlivnilo splnění USP kritérií, pokud se neočekávají aminokyseliny v matrice.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a reprodukovatelnou kontrolu čistoty heparinu v QA/QC laboratořích farmacie. Díky automatizovanému generování elučního pufru se zásadně snižuje riziko chyb v přípravě hodnotících roztoků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Úspěšná aplikace HPAE-PAD otevírá prostor pro online hydrolýzu a multi-analytické skríningy polysacharidů, integraci s hmotnostní spektrometrií i plnou automatizaci metody. Další rozšíření lze očekávat v monitoringu biologických vzorků a normalizaci farmaceutických analýz.

Závěr

Implementovaná HPAE-PAD metoda s CarboPac PA20 sloupcem splňuje požadavky USP na stanovení galaktosaminy v heparinu, prokazuje vysokou citlivost, reprodukovatelnost a robustnost při různých eluentních systémech i sloupcových konfiguracích.

Reference

• World Health Organization Alert No. 118, 2008
• FDA Public Health Update, 2008
• Guerrini M. et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 669–675
• Pharmacopeial Forum 2009, 35, 1–10
• Dionex Application Note 235, LPN 2306, 2009
• Dionex Technical Note 21, LPN 034889-03, 1998
• Dionex Technical Note 71, LPN 1932-01, 2007