Mastering HILIC-Z Separation for Polar Analytes

Význam tématu

Hydrofinní interakční liquidní chromatografie typu HILIC-Z se stala klíčovou metodou pro separaci malých polárních molekul včetně metabolitů bez potřeby iontově páracích činidel. Díky své schopnosti vytvářet stabilní vodnou vrstvu na stacionární fázi a využití zwitteriontových povrchů nabízí metoda vysokou selektivitu, reprodukovatelné retenční časy a ostré chromatografické píky. Význam spočívá ve snadnější integraci do metabolomických workflow, snížení rizika kontaminace LC systému a ve schopnosti separovat isobarické a isomerické látky bez komplexních úprav vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo předvést doporučené zásady použití kolony Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z pro globální separaci polárních metabolit. Studie demonstrovala, že i při multidením provozu a práci s komplexní matricí lze dosáhnout konzistentních píkových tvarů, stabilních retenčních časů a stálých hodnot tlaku na sloupci. Přehled zahrnuje optimalizaci přípravy mobilních fází, režimu praní a skladování kolony, stejně jako ukázkovou metodu pro chromatografii polarů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl využit HPLC systém Agilent 1290 Infinity II bio LC vybaven vysokorychlostním čerpadlem, multisamplerem s multiwash moduly, sloupcovým termostatem a Agilent InfinityLab Quick Change 2-pozicovým ventilem. Jako kolona sloužila Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (2,1×150 mm, 2,7 μm). Mobilní fáze A: 20 mM acetát amonný pH 9,3 s medronovou kyselinou, B: acetonitril. Gradient trval 24 minut při 0,4 ml/min, kolona byla chlazena na 15 °C. Pro přípravu vzorků se doporučuje 80 % acetonitril/20 % voda s menší injekční objemem pro vyšší vodní obsah.
Pro předúpravu a prodloužení životnosti se proplachovalo: nejprve vodou, dále isopropanolem a nakonec kyselinou pyrofosforečnou v 90 % acetonitrilu po dobu 12–18 hodin. Veškeré sklo a pH metry byly dedikovány metodě a pravidelně kalibrovány.

Hlavní výsledky a diskuse

Retenční časy více než 20 analyzovaných metabolit byly stabilní po osm dní napříč třemi sloupci a šesti šaržemi mobilních fází. Maximální odchylka retenčního času u středně raných analytů nepřesáhla 0,8 minuty, u raných a pozdních píků byla <0,3 minuty. Je zachována separace isobarických aminokyselin leucinu a isoleucinu a stabilita tlakových průběhů u biologických extraktů bez zvýšení backpressure. Rozložení různých tříd metabolitů (aminokyseliny, organické kyseliny, nukleotidy, fosforylované sloučeniny) pokrývá celý gradient, což umožňuje komplexní metabolomické analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění potřeby iontově páracích činidel a souvisejících problémů s kontaminací LC systému.
• Vysoká reprodukovatelnost retenčních časů vhodná pro dlouhodobé studie a standardizaci metodiky.
• Široké pH (2–12) a teplotní rozsahy (5–80 °C) pro flexibilní aplikace.
• Možnost přímého nasazení v cíleném i necíleném (untargeted) metabolomickém workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj multitaskových metod kombinujících HILIC-Z separaci s rychlými MS/MS přechody (dMRM), vysokorozlišenou Q-TOF detekcí a automatizovanou přípravou vzorků. Potenciálem jsou aplikace v klinických studiích, farmaceutickém vývoji a průmyslové kontrole kvality. Integrace s datovými nástroji pro nekódované vyhledávání a strojové učení přispěje k efektivní detekci biomarkerů a vysokoobjemovým screeningům.

Závěr

Metoda HILIC-Z na sloupci Agilent Poroshell 120 poskytuje spolehlivé a reprodukovatelné rozdělení polárních analyzů bez použití iontově páracích činidel. Díky optimalizované přípravě mobilních fází, režimu proplachu a dedikovanému vybavení lze dosáhnout dlouhodobé stability retenčních časů a tlaku. Přístup zjednodušuje komplexní metabolomické workflow a otevírá prostor pro standardizované, vysoce propustné aplikace.

Reference

1. Hydrophilic Interaction Chromatography Method Development and Troubleshooting, Agilent Technologies technical overview, 2018.
2. Wei T-C et al. The Use of HILIC-Zwitterionic Phase Superficially Porous Particles for Metabolomics Analysis, LCGC Supplements, 2018.
3. Mack A, Wei T-C. Analysis of Sugars Using an Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z Column, Agilent Technologies application note, 2019.
4. Yannell KE et al. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow, Agilent Technologies application note, 2023.
5. Sartain M et al. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform, Agilent Technologies application note, 2020.
6. Van de Bittner G et al. An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples, Agilent Technologies technical overview, 2022.