Determination of Tobramycin and Impurities Using HPAE-PAD

Význam tématu

Tobramycin je aminoglykosidové antibiotikum používané v oftalmických a nitrožilních formulacích. Monitorování jeho čistoty a odhalování nečistot (kanamycin B, nebramine, neamine) je klíčové pro splnění klinických a farmakopejních limitů. Klíčovým problémem je absence chromoforu, což omezuje detekci UV metodami.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je demonstrovat vylepšenou metodiku HPAE-PAD s automatickou generací elučního roztoku a disposabilními zlatými elektrodami pro robustní, citlivé a reprodukovatelné stanovení tobramycinu a jeho nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém Dionex BioLC s pumpami GP50/IP25 a vakuovým degasem
• Aniontová výměnná kolona CarboPac PA1 (analytická a strážní)
• Eluentní generátor EG50 s cartridgem EGC II KOH a CR-ATC aniontovým filtrem
• Pulsně amperometrický detektor ED50 s disposabilními zlatými elektrodami (Carbohydrate a AAA-Direct waveforms)
• Autosampler AS50, Chromeleon pro akvizici dat
• Podmínky: 2 mM KOH, isokratická eluce, průtok 0,5 ml/min, teplota 30 °C, objem injekce 20 µl

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení tobramycinu a nečistot: R > 6, splňuje požadavek Pharm. Eur. (R > 3)
• Lineární rozsah: 0,03–38 µM (tři řády velikosti)
• Mez detekce (LOD): 0,22–2,3 pmol; mez kvantifikace (LOQ): 0,72–7,5 pmol
• Reprodukovatelnost: retenční časy RSD 0,2–0,4 %, plocha piku RSD 1,1–4,0 %
• Robustnost: konstantní eluentní koncentrace automatickým generátorem, změny průtoku a výměna kolony dobře tolerovány

Přínosy a praktické využití metody

• Automatická příprava elučního roztoku eliminuje variabilitu způsobenou karbonátem a manuální přípravou
• Vysoká citlivost a specifita detekce bez nutnosti derivatizace
• Jednoduchá údržba disposabilních zlatých elektrod a nižší režie laboratorního provozu
• Metoda vhodná pro QA/QC farmaceutické výroby a výzkumné laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na další aminoglykosidy a sacharidové analýzy
• Integrace pokročilých vlnových forem detekce pro zvýšení citlivosti
• Online monitorování fermentačních procesů pomocí HPAE-PAD
• Propojení s hmotnostní spektrometrií pro potvrzování struktur nečistot

Závěr

Metoda HPAE-PAD s eluentní generací a disposabilními zlatými elektrodami nabízí robustní, citlivé a reprodukovatelné stanovení tobramycinu a jeho nečistot v souladu s farmakopejními požadavky. Automatizace přípravy elučních roztoků minimalizuje zdroje variability.

Reference

• 1. Physicians’ Desk Reference PDR 44th Edition, 1990.
• 2. European Pharmacopoeia, Fifth Edition, 2004.
• 3. Szunyog J. et al. Analysis of Tobramycin by Liquid Chromatography with Pulsed Electrochemical Detection. J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 23, 891–896.
• 4. Polta J. A. et al. Liquid-Chromatographic Separation of Aminoglycosides with Pulsed Amperometric Detection. J. Chromatogr. 1985, 324, 407–414.
• 5. Dionex Corp. Tobramycin in Pharmaceutical Formulations. Application Note 61, 1989.
• 6. Statler J. A. Determination of Tobramycin Using High-Performance Liquid Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. J. Chromatogr. 1990, 92, 244–246.
• 7. Cheng J. et al. Development and Characterization of Microfabricated Disposable Gold Working Electrodes for High-Performance Ion Chromatography. Anal. Chem. 2003, 75, 572–579.
• 8. Cheng J. et al. Use of Disposable Gold Working Electrodes for Cation Chromatography-Integrated Pulsed Amperometric Detection of Sulfur-Containing Amino Acids. J. Chromatogr. A 2003, 997, 73–78.
• 9. ICH Q2A Validation of Analytical Procedures, 1994.
• 10. ICH Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, 1996.
• 11. FDA Guidance for Industry Analytical Procedures and Method Validation, 2000.
• 12. FDA Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods, 1994.
• 13. FDA Guidance Bioanalytical Method Validation, 2001.
• 14. USP <1225> Validation of Compendial Methods, 2004.
• 15. USP <621> Chromatography, 2004.
• 16. Dionex Technical Note 21 Optimal Settings for Pulsed Amperometric Detection, 1997.
• 17. Dionex Product Manual AAA-Direct Amino Acid Analysis System, 2003.
• 18. WHO CRS Neamine Hydrochloride, Cat. 9930354.