ZebraWash: An innovative approach in the Vanquish Neo UHPLC system to reduce trap column carryover

Význam tématu

V nízkoprůtokové LC-MS proteomice je klíčové dosáhnout vysoké vzorkové průchodnosti bez rizika křížové kontaminace mezi injekcemi. Workflow trap-and-elute přináší významné zkrácení času nahrávání vzorku, avšak použití krátkého pasty na kolonu může způsobit výrazný carryover silně adsorbovaných látek. Vysoce efektivní a automatizované odstranění carryover přispívá k vyšší spolehlivosti kvantitativních výsledků a stabilitě analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje novou proceduru ZebraWash integrovanou do systému Thermo Scientific™ Vanquish™ Neo UHPLC. Cílem bylo demonstrovat rychlé a účinné snížení carryover na pastové koloně v trap-and-elute režimu pro nanoLC-MS aplikace, přičemž byla zachována vysoká vzorková průchodnost a kvalita výsledků.

Použitá metodika

Popis workflow trap-and-elute:

• Vzorek HeLa digest doplněný PRTC standardem byl injectován na krátkou trap kolonu (5–20 mm) při vyšším průtoku.
• Separace probíhala následným přesměrováním gradientu přes trap i analytickou kolonu (75 µm × 500 mm nebo 75 µm × 150 mm).
• ZebraWash procedura alternuje silný a slabý mycí roztok přímo z mycího portu: jeden cyklus = 3 µL silného roztoku + 3 µL slabého roztoku.
• Po definovaném počtu cyklů se kolona a fluidika re-ekvilibrují slabým roztokem před dalším vzorkem.

Použitá instrumentace

• Vanquish Neo UHPLC System (Binary Pump N, Split Sampler NT, Solvent Rack, System Controller)
• Vanquish Display
• Kolony: Thermo Scientific™ EASY-Spray™ PepMap™ Neo UHPLC 75 µm×500 mm a Acclaim™ PepMap™ C18 75 µm×150 mm
• Mass spectrometr: Thermo Scientific™ Orbitrap™ Exploris™ 480 v DDA režimu
• Spotřební materiál: LC-MS grade voda, acetonitril, isopropanol, formic acid

Hlavní výsledky a diskuse

• ZebraWash s 16 cykly (100 µL vzorková smyčka) dosahuje carryover na trap kolonu pod 0,004 % nezávisle na dávce (200–4 000 ng).
• Celkový carryover (částice z fluidiky, trap i analytické kolony) zůstává pod 0,05 % pro dávky až 4 000 ng.
• Porovnání s klasickou Fast Wash ukazuje vyšší efektivitu při stejné spotřebě silného roztoku – čtyři cykly ZebraWash přinesly nižší carryover než Fast Wash s objemem 12 µL silného roztoku.
• Doba mytí a ekvilibrace pasty při 4 cyklech je přibližně 6 min při průtoku ~12 µL/min a tlaku 800 bar.
• Vzestup dávky zvyšuje carryover separační kolony, doporučuje se optimalizovat cykly podle objemu trap smyčky.

Přínosy a praktické využití metody

Procedura ZebraWash přináší:

• Automatizované a paralelní mytí trap i analytické kolony bez potřeby prázdných běhů mezi vzorky.
• Výrazné snížení křížové kontaminace a zvýšení spolehlivosti kvantifikace.
• Zachování vysoké vzorkové průchodnosti a zkrácení doby analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Přizpůsobení složení mycích roztoků (acetonitril, isopropanol, metanol) pro různé typy vzorků a kontaminantů.
• Optimalizace počtu cyklů pro vyšší i.d. trap kolony a kapilární/mikro-LC aplikace.
• Integrace metody do vysokopropustných proteomických platforem a online automatizovaných pracovních postupů.
• Potenciální rozšíření na malé molekuly a metabolomické analýzy s minimalizovaným carryover.

Závěr

ZebraWash v systému Vanquish Neo UHPLC představuje vysoce výkonné řešení pro rychlé a efektivní odstranění carryover na trap kolonu v trap-and-elute režimu. Metoda zajišťuje minimální kontaminaci, zachování vysoké vzorkové průchodnosti a robustnost výsledků v náročných nanoLC-MS aplikacích.

Reference

• Runsheng Zheng et al., Technical note TN000816-EN, Thermo Fisher Scientific, 2022.
• Thermo Scientific™ Proteome Discoverer™ 2.5, SEQUEST™ HT & INFERYS, Thermo Fisher Scientific.