Multi-draw: Enabling large volume injections for lyophilization-free LC-MS proteomics workflows on the Vanquish Neo UHPLC system

Význam tématu

Analýza proteomů metodou bottom-up LC-MS je klíčová pro identifikaci a kvantifikaci proteinů v biomedicínském výzkumu i průmyslové analytice. Tradiční příprava vzorků zahrnuje lyofilizaci a rekonstituci, která je časově náročná a může vést ke ztrátě vodou špatně rozpustných peptidů. Vyvinutá bezlyofilizační práce protokol využívá velkoobjemové vstřiky s cílem zrychlit workflow, minimalizovat ztráty a zachovat vysokou citlivost a reprodukovatelnost měření.

Cíle a přehled studie

• Ověřit funkčnost multi-draw injekčního režimu na systému Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC pro objemy až 500 µL.
• Srovnat standardní vstřik 5 µL koncentrovaného HeLa digestu s velkoobjemovým vstřikem řádově 500 µL řídkého roztoku.
• Posoudit dopad na chromatografii, identifikaci peptidů/proteinů a kvantitativní výkon.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky HeLa digestu s interním PRTC standardem byly připraveny ve 0,1 % TFA v těsném pufru a naředěny na 2 ng/µL pro velkoobjemové vstřiky. Multi-draw režim využívá 100 µL vzorkovou smyčku a opakované aspirace o rychlosti 20 µL/s. Vzorek se následně při tlaku 800 bar a průtoku 200 µL/min načítá na trap kolonu 300 µm × 5 mm.

• UHPLC systém Vanquish Neo
• Orbitrap Exploris 480 v režimu DDA
• EASY-Spray PepMap Neo analytická kolona 75 µm × 150 mm, 2 µm
• PepMap Neo trap cartridge 300 µm × 5 mm, 5 µm
• Vzorková smyčka 100 µL, 1,5 mL total recovery vial
• Software Xcalibur SII a Proteome Discoverer 2.5 se SEQUEST HT a INFERYS rescoring

Hlavní výsledky a diskuse

• Celkové iontové chromatogramy i retenční časy 15 PRTC peptidů byly téměř identické pro 5 µL a 500 µL vstřiky.
• Počet identifikovaných peptidových skupin a proteinů se nelišil mezi standardním a velkoobjemovým režimem, což dokládá ekvivalentní podíl vzorku na kolóně.
• Kvantitativní korelace vrcholových ploch dosáhla koeficientů kolem 0,9 a nevykázala systematický bias ani ztrátu hydrofilních peptidů díky 0,1 % TFA v načítacím pufru.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění lyofilizace a rekonstituce zkracuje dobu přípravy a snižuje operativní náklady.
• Plně automatizovaný multi-draw běh v Xcalibur vyžaduje pouze nastavení objemu nad 100 µL bez další programace.
• Zachovává vysokou citlivost a reprodukovatelnost i při nízké koncentraci vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Workflow lze rozšířit na nano- a kapilární aplikace v klinické a farmaceutické proteomice, dále optimalizovat ion-pairing pufry a rozšiřovat automatizované protokoly pro vysokopropustné analýzy a validaci v QA/QC laboratořích.

Závěr

Multi-draw funkce Vanquish Neo UHPLC umožňuje spolehlivé a rychlé velkoobjemové vstřiky bez lyofilizace. Metoda zachovává hloubku proteomické analýzy, kvantitativní přesnost a výrazně zvyšuje pracovní efektivitu v bottom-up LC-MS proteomice.

Reference

1. Zheng R et al. Fast, sensitive, and reproducible nano- and capillary-flow LCMS methods for high-throughput proteome profiling using the Vanquish Neo UHPLC system with the Orbitrap Exploris 480 MS Technical Note 000138 Thermo Fisher Scientific
2. R Core Team R: A language and environment for statistical computing R Foundation for Statistical Computing Vienna Austria 2020