Fast, sensitive, and reproducible nano- and capillary-flow LCMS methods for high− throughput proteome profiling using the Vanquish Neo UHPLC system hyphenated with the Orbitrap Exploris 480 MS

Význam tématu

Rychlé a vysoce výtěžné proteomické analýzy umožňují zpracování rozsáhlých souborů vzorků a zkracují dobu potřebnou pro profilování proteomu.
Optimalizace LC-MS metod s vysokou využitelností hmotového spektrometru je klíčová pro aplikace v klinické, farmaceutické a biotechnologické oblasti, kde je nutné analyzovat stovky až tisíce vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat výkon Vanquish Neo UHPLC systému spojeného s Orbitrap Exploris 480 MS při high-throughput bottom-up proteomice.
Bylo vyvinuto pět metod s celkovou dobou běhu 6,6; 13,0; 22,6; 46,6 a 58,6 minut, odpovídající kapacitám 180; 100; 60; 30 a 24 vzorků za den.

Použitá instrumentace

• Vanquish Neo UHPLC system
• Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer
• EASY-Spray PepMap Neo column 75 μm × 150 mm 2 μm
• PepMap Neo trap column 300 μm × 5 mm 5 μm

Hlavní výsledky a diskuse

• MS využitelnost se pohybovala mezi 68 a 95 procenty podle délky cyklu metody
• Šířka píků (FWHM) byla mezi 2 a 11 sekundami, kratší metody poskytovaly vyšší chromatografickou ostrost
• Při 8min metodě bylo identifikováno přes 1200 proteinů, u 60min metody přes 4000 proteinů (1 % FDR)
• Intra- a inter-column variabilita identifikací dosahovala RSD nižších než 2 %, mezi třemi kolonami do 6 %
• Stabilní retence standardních peptidů s RSD mezi 1,1 a 5,5 % během 100 po sobě jdoucích injekcí
• Interlaboratorní reproducibilita ukázala 72,5 až 88,5 % společných proteinů napříč třemi místy

Přínosy a praktické využití metody

Rychlé cykly a vysoká stabilita podporují analýzu rozsáhlých souborů vzorků bez nutnosti výměny kolon mezi metodami.
Vysoká reprodukovatelnost a robustnost usnadňuje validaci biomarkerů a studie založené na statisticky významných datech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na datově nezávislou akvizici (DIA) pro hlubší proteomické analýzy
• Integrace s automatizovanými pracovními postupy pro vyšší propustnost
• Využití delších kolon pro maximalizaci pokrytí proteomu v klinických studiích
• Vývoj multi-omics přístupů kombinujících proteomiku s metabolomikou a genomikou

Závěr

Vanquish Neo UHPLC spojený s Orbitrap Exploris 480 ukázal mimořádnou výkonnost v kombinaci rychlosti, citlivosti a reprodukovatelnosti.
Pět optimalizovaných metod poskytuje flexibilní sadu nástrojů pro rychlé a robustní bottom-up proteomické studie v průmyslovém i akademickém prostředí.

Reference

• Lopez-Ferrer D Andrade A Huguet R Pushing the limits of bottom-up proteomics with state-of-the-art capillary UHPLC and Orbitrap mass spectrometry Application Note 639 2016
• Boychenko A Pynn C Arrey T Tailored high-throughput low-flow LC-MS methods for large sample cohort analysis Technical Note TN73208
• Bian Y Zheng R Bayer FP Robust reproducible quantitative analysis of thousands of proteomes by micro-flow LC-MS/MS Nat Commun 11 157 2020
• R Core Team R A language and environment for statistical computing R Foundation 2020
• Schilling B Rardin MJ MacLean B Platform-independent and label-free quantitation using MS1 extracted ion chromatograms in Skyline Mol Cell Proteomics 2012